新藤黄酸通过调控细胞自噬提高人肝癌BEL-7402/ADM细胞敏感性的研究

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自噬(Autophagy)是细胞的自我降解过程,通过降解损伤的细胞器以及大分子物质,并回收利用分解产物,特别是在化疗药物、生长因子剥夺等条件下能维持细胞稳态。细胞自噬是把双刃剑,机体一方面可通过自噬杀伤或清除肿瘤细胞,另一方面也为肿瘤细胞的生长提供必要的养料和能量。化疗药物、辐射等外界压力作用于肿瘤细胞时,肿瘤细胞可通过调控细胞自噬水平来抵抗抗癌药物或辐射的杀伤作用,增强肿瘤细胞的存活率和耐受性。新藤黄酸(Gambogenic acid,GNA)作为一种中药活性成分,课题组前期对其研究结果显示,新藤黄酸具有良好的抗肿瘤作用,其作用机制与调控线粒体氧化应激、诱导细胞凋亡和抑制肿瘤细胞保护性自噬等相关。低剂量配伍化疗药物能够逆转肿瘤耐药,但逆转作用途径和作用靶点尚不清楚。基于肿瘤细胞自噬与耐药性之间的关系,本课题探讨GNA逆转耐药与其调控细胞自噬的相关性以及相关作用靶点的初步定位。期望通过本研究为GNA的进一步开发利用提供理论依据。目的:本课题通过检测人肝癌耐药细胞株BEL-7402/ADM和亲本BEL-7402细胞株的基础自噬水平,明确自噬与细胞耐药性的关系,探讨GNA能否通过调控细胞自噬水平提高BEL-7402/ADM细胞的敏感性。方法:1、MTT法检测BEL-7402与BEL-7402/ADM细胞的增殖活性;Western blot法检测耐药相关蛋白P-gp的表达水平;2、MTT法筛选GNA对细胞的安全用药浓度,以及使用各指定药物作用后对细胞增殖的影响;3、单丹磺酰尸胺(MDC)荧光染色和透射电子显微镜观察自噬小体;Western blot法检测基础自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin1、P62的表达水平;4、MDC染色和透射电子显微镜进行自噬形态学检测;Western blot法检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin1、P62的表达水平;5、倒置显微镜观察细胞状态;DAPI染色荧光显微镜观察细胞核变化;采用流式细胞仪检测细胞凋亡率;Western blot检测Caspase-3、Bax和Bcl-2的表达水平。结果:1、BEL-7402/ADM细胞对阿霉素的敏感性较低,12h、24h、48h的IC50值分别是BEL-7402细胞的16.7倍、17.0倍、18.5倍;Western blot法检测结果表明与耐药相关的蛋白P-gp在BEL-7402/ADM细胞内高表达,而在BEL-7402细胞内低表达。2、GNA提高了耐药细胞对阿霉素的敏感性,GNA作用于BEL-7402/ADM细胞12h、24h、48h的IC90值分别为7.01μmol/L、3.36μmol/L、2.17μmol/L,最终选择2μmol/L的GNA预处理细胞3h后加入阿霉素作用12h、24h、48h,IC50值分别是单独使用阿霉素组的0.79倍、0.48倍、0.30倍。3、BEL-7402/ADM细胞基础自噬水平明显高于BEL-7402细胞,与BEL-7402细胞比较,BEL-7402/ADM细胞中出现更多的自噬泡荧光堆积和典型的自噬泡结构,同时BEL-7402/ADM细胞中自噬相关蛋白Beclin1和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明显高于BEL-7402细胞,P62蛋白水平较BEL-7402细胞中低。4、GNA抑制自噬水平提高BEL-7402/ADM细胞对阿霉素的敏感性。GNA预处理组能够增强自噬泡荧光堆积和出现更多典型的自噬泡结构;同时,BEL-7402/ADM细胞中自噬相关蛋白Beclin1和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值也高于BEL-7402细胞,但是P62蛋白水平较BEL-7402细胞中明显升高。5、GNA处理BEL-7402/ADM细胞后增强了阿霉素诱导的细胞凋亡。GNA预处理的组别,细胞发生了明显的凋亡形态学变化,流式细胞仪检测发现细胞凋亡率增加;同时,Caspase-3蛋白的水平和Bax/Bcl-2蛋白比值均明显增加。结论:与BEL-7402细胞相比,BEL-7402/ADM细胞具有较高的基础自噬水平,说明自噬参与了细胞耐药的形成;而GNA能够逆转BEL-7402/ADM细胞对阿霉素的耐药性可能是GNA抑制了BEL-7402/ADM细胞的自噬诱导细胞发生凋亡。
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