稳定表达gBST-2蛋白Vero细胞系的构建及其对PPRV增殖特性的影响

来源 :安徽农业大学 | 被引量 : 3次 | 上传用户:w198911154
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小反刍兽疫是由副粘病毒科麻疹病毒属中的小反刍兽疫病毒(Peste des Petits Ruminants Virus,PPRV)引起的,主要感染山羊和绵羊,临床以发热、口炎、腹泻、肺炎等为特征,发病率和死亡率高达90%以上,为农业部一类动物疫病。PPRV是一种具有囊膜的RNA病毒,其复制和出芽机制尚不完全清楚。BST-2作为干扰素诱导表达的天然免疫限制因子,在哺乳动物成熟B细胞、单核细胞、T细胞、巨噬细胞、类浆树突状细胞、巨噬细胞中都有表达。为了研究BST-2在PPRV复制和出芽过程的作用机制,进行了本论文研究。首先,根据GenBank中山羊BST-2的基因序列(登录号:XM018051380.1)设计了一对特异性引物,以pUC-gBST-2质粒为模板,PCR扩增山羊BST-2基因,并插入到pLOV-GFP-3×Flag载体,构建了重组质粒pLOV-gBST-2。利用钙转染法将重组质粒pLOV-gBST-2、外膜质粒pMD2.G和包装质粒psPAX2共转染293T细胞,获得一株gBST-2基因重组慢病毒。将含gBST-2基因的重组慢病毒感染Vero细胞,利用嘌呤霉素加压筛选,获得一株稳定表达gBST-2蛋白的细胞系,命名为Vero-gBST-2细胞系。将该细胞系连续传代15代,经过PCR、RT-PCR、Western blot检测表明Vero-gBST-2细胞系能稳定持续表达gBST-2蛋白,gBST-2蛋白主要定位在Vero细胞的细胞膜上。应用PPRV感染Vero-gBST-2细胞系,进一步研究gBST-2蛋白对PPRV增殖特性的影响,绘制PPRV在Vero-gBST-2细胞中的一步生长曲线。结果显示,PPRV在Vero-gBST-2细胞系增殖不佳,病毒滴度降低,gBST-2蛋白能明显地限制PPRV复制。PPRV感染后48h、72h、96h收取的细胞进行Western blot检测,发现感染的Vero-gBST-2细胞中病毒粒子的产量减少。结果初步表明,gBST-2蛋白能限制PPRV的复制和出芽。应用激光共聚焦检测发现,gBST-2蛋白与PPRV存在共定位。综上所述,本研究构建的Vero-gBST-2细胞系能稳定持续表达gBST-2蛋白,gBST-2蛋白能够限制PPRV的增殖。研究结果为探究PPRV的致病机制以及宿主对抗病毒感染天然免疫提供了平台。
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