随着经济的发展，人口平均寿命的延长，糖尿病等慢性疾病的发病率也呈逐年上升趋势。自1990年到2010年，全球糖尿病患病率上升近4倍。我国是糖尿病大国，2007-2008年20岁以上人群糖尿病患病率为9.7％，2010年为9.65％。众所周知，糖尿病的主要危害不在于其疾病的本身，而是其在全身各系统器官并发症。近年，糖尿病相关的骨代谢、骨微结构的改变所致骨折风险增高引起医学界的广泛注意。　　骨质疏松症作为一种常见的代谢性骨病，其受到遗传的影响非常强。骨质疏松症的主要特征是在骨组织中的骨量的减少和缺陷，进而削弱骨的强度并导致脆性骨折的风险增加。近三分之一妇女遭受着骨质疏松症的影响，同时，在50岁以上男性中，其中每八个人就有一个遭受着骨质疏松症的影响。由于骨量在成年期后就随年龄逐渐减少，所以骨质疏松被公认为是老年人的常见疾病，由于在骨折发生时缺乏明显的征兆，故又称为沉默疾病。骨质疏松症分为两类:绝经后骨质疏松症（1型骨质疏松症），是绝经后的女性是最常见的疾病，与雌激素缺乏相关;老年性骨质疏松症（2型骨质疏松症）与老龄化、膳食中钙的缺乏、维生素D下降、甲状旁腺的活动增加以及糖尿病等疾病密切相关。　　铁超载与骨质疏松之间的关系已得到证实。Weiss G等发现在血色素沉着症中，伴随铁的过量沉积，63％的患者出现骨质疏松;Chen B等研究发现，铁超载具有明显的成骨抑制作用，而这种作用可以被铁离子螯合剂去铁胺所拮抗;Li GF等认为骨质疏松与铁超载具有明显的相关性。但铁超载在糖尿病骨微结构改变中是否起到主要作用，目前尚不明确。　　在糖尿病及其相关并发症中，糖基化终末产物(advanced glycosylation endprodrcts，AGEs)起到重要作用。研究发现，随着2型糖尿病大鼠体内AGEs的增加，骨微结构可出现显著变化。同时，AGEs可以导致成骨细胞内铁离子超载。因此，我们推测糖尿病骨微结构改变与铁离子超载密切相关，但在糖尿病骨微结构改变中，引起成骨细胞铁超载的具体机制尚不明确。　　二价金属离子转运体1(divalent metal transporter1，DMT1)是哺乳类跨膜金属离子转运体。这种转运体广泛分布于人体各组织，其主要功能是介导细胞铁吸收，以及参与铁从内吞小体移位到胞浆的过程。DMT1的表达增加可以使细胞内铁聚集，造成铁超载。有研究证实糖尿病患者血糖浓度升高，可诱导成骨细胞表面DMT1的重新分布，使得成骨细胞表面的DMT1表达增高。但在2型糖尿病中，成骨细胞的铁离子超载是否由DMT1过表达引起，还有待进一步研究。　　铁代谢对于维持机体正常功能，参与各种生化反应都发挥十分重要的作用。Chew KC等发现，在SH-SY5Y细胞（神经母细胞瘤细胞）中，由于DMT1的过表达，导致细胞内铁离子增多，引起细胞自噬。因此，DMT1表达与铁超载之间存在着紧密的联系。同时，一些相关研究也表明了，铁超载可以诱导细胞自噬和细胞凋亡。然而，从没有研究报道表明，在成骨细胞中，通过DMT1的表达调节二价铁离子的浓度从而影响细胞自噬，进而影响细胞凋亡。并且DMT1与自噬的关系及具体机制仍不明确，有待进一步研究。　　自噬是真核细胞降解并回收受损大分子和细胞器的主要代谢过程。在这一过程中，细胞内的蛋白或者受损的细胞器被有双层结构膜的自噬体所吞噬，然后溶酶体与该膜性结构结合将其中的成分降解，并最终被利用于细胞的合成与代谢能力。在所有细胞中低水平的自噬可以确保长寿蛋白及细胞器稳态的循环利用，并且在细胞遭受应激损伤的时候，细胞自噬可以被显著的增强。最近的研究表明，自噬在骨生成中扮演一个复杂而重要的角色。同时，细胞自噬与细胞凋亡密切相关。在有些情况下，自噬构成应激保护的作用从而抑制细胞凋亡，而在另一些情况下，自噬却构成了另一种细胞死亡的通路。然而，在成骨细胞铁过载如何影响自噬的病理机制仍不清楚。　　因此，本课题主要通过研究DMT1对高铁环境下成骨细胞自噬及凋亡的影响，观察高铁环境下成骨细胞自噬及凋亡的变化，探讨DMT1对成骨细胞自噬的调控作用，及其对成骨细胞功能的影响。　　方法:第一部分:利用MTT法检测不同浓度不同时间点FAC作用下对成骨细胞活力的影响;使用细胞AnnexinⅤ-PE/7AAD双染流式细胞仪计数方法检测高浓度FAC对成骨细胞凋亡的影响;使用PI单染流式细胞仪计数及;使用WesternBlot法检测FAC作用下成骨细胞DMT1蛋白表达情况。　　第二部分:利用MTT法检测FAC作用下对成骨细胞活力的影响;使用WesternBlot法检测FAC作用下成骨细胞自噬相关蛋白LC3Ⅰ/LC3Ⅱ、Beclin-1、凋亡相关蛋白cleaved caspase3、BCL2 and BAX及DMT1表达情况;使用透射电子显微镜观察FAC作用下成骨细胞内自噬体数量;分别使用免疫荧光染色FAC作用下成骨细胞内源性LC3点簇状聚集及DMT1表达情况;使用DMT1 shRNA慢病毒感染成骨细胞，并删选稳定表达细胞株;使用细胞AnnexinⅤ-PE/7AAD双染流式细胞仪计数方法检测DMT1 shRNA作用下FAC对成骨细胞凋亡的影响;使用Western Blot法检测DMT1 shRNA作用下FAC对成骨细胞自噬相关蛋白LC3Ⅰ/LC3Ⅱ、Beclin-1、凋亡相关蛋白cleaved caspase3、BCL2 and BAX及DMT1表达情况。　　第三部分:使用stubRFP-SensGFP-LC3慢病毒感染观察FAC作用下成骨细胞自噬流的情况;使用Western Blot法检测FAC对成骨细胞LC3Ⅰ/LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白以及JNK通路蛋白的影响;使用DMT1 shRNA慢病毒感染成骨细胞，并删选稳定表达细胞株;MTT法检测DMT1 shRNA作用下FAC对成骨细胞活力的影响;使用细胞AnnexinⅤ-PE/7AAD双染流式细胞仪计数方法检测DMT1 shRNA作用下FAC对成骨细胞凋亡的影响;使用Western Blot法检测DMT1 shRNA作用下FAC对成骨细胞自噬相关蛋白LC3Ⅰ/LC3Ⅱ、Beelin-1以及JNK通路蛋白的影响;使用Western Blot检测OPG、OCN蛋白的变化;使用茜素红染色检测FAC单独作用或与DMT1 shRNA联合作用下对成骨细胞钙结节数量的影响。　　结果:第一部分:FAC对hFOB1.19细胞活力产生抑制作用:与对照组相比，FAC在300μmol/L作用12h、24h时可明显抑制细胞活力，其中24h时作用最为明显，细胞存活率约为50％;流式检测不同浓度的FAC(0，50，100，200，300，400，500μmol/L)作用于人成骨细胞hFOB1.1924小时，发现随着FAC浓度的增加，与对照组细胞相比细胞凋亡率显著增加;流式周期检测显示:不同浓度的FAC(0，50，100，200，300，400，500μmol/L)作用于hFOB1.19细胞24h后，发现随着FAC浓度的增加，与对照组相比可以显著的抑制S期hFOB1.19细胞的数量;FAC可以上调成骨细胞DMT1蛋白表达，且具有时间依赖性和浓度依赖性。　　第二部分:我们发现，3-甲基腺嘌呤（3-MA）明显地加强了在300μmol/L FAC作用24小时后FAC对hFOB1.19细胞活力的抑制作用，这表明FAC对成骨细胞hFOB1.19活力的抑制与细胞自噬密切相关;同时，在300μmol/L FAC对hFOB1.19细胞处理24小时后DMT1表达明显增高;之后，我们对成骨细胞hFOB1.19进行了DMT1 shRNA病毒转染;此外，我们也发现通过抑制细胞自噬可以显著的增加半胱氨酸蛋白酶途径依赖的FAC诱导的细胞凋亡，但在DMT1 shRNA hFOB1.19细胞中半胱氨酸蛋白酶途径依赖的FAC诱导的细胞凋亡会被减弱;最后，我们的研究结果表明通过FAC的诱导可以使成骨细胞hFOB1.19内的自噬体增多，并且通过调控DMT1的表达可以减少这种细胞内自噬体积累的现象。　　第三部分:首先，我们用stubRFP-sensGFP-LC3慢病毒感染成骨细胞hFOB1.19，结果发现，FAC可以同时增加点簇状黄色荧光(自噬体，GFP+/RFP+)及点簇状红色荧光（自噬溶酶体，GFP-/RFP+）聚集;其次，我们使用免疫印迹技术(westernblotting)和茜素红染色来研究通过DMT1介导的成骨细胞hFOB1.19相关成骨功能指标，结果发现，通过抑制FAC诱导的细胞自噬可以显著的抑制成骨细胞hFOB1.19OPG和OCN的表达并减少钙结节的数量，但在加入DMT1 shRNA后，其成骨功能与FAC组相比明显增强;之后，通过对JNK信号通路的研究我们发现，DMT1可以调节细胞内铁离子浓度诱导的hFOB1.19细胞自噬进而影响细胞的成骨功能，而JNK信号通路在其中起到关键作用。　　结论:第一部分:FAC对成骨细胞hFOB1.19的增殖起到抑制作用，且随着FAC浓度的增高和作用时间的加长，其产生的抑制作用也随之加强。同时，在FAC对成骨细胞hFOB1.19的增殖的抑制作用中DMT1可能在其中起到了至关重要的作用。　　第二部分:在FAC对成骨细胞hFOB1.19的增殖起到抑制作用中，自噬起到至关重要的作用;同时，FAC可以通过上调DMT1，从而增强成骨细胞内自噬体的聚集，促进细胞自噬，进而抑制细胞凋亡，并且DMT1在此过程中起到至关重要的作用。　　第三部分:FAC可以上调DMT1的表达，进而激活JNK通路，从而增强细胞自噬，影响细胞成骨功能。