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β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)俗称乳糖酶,不仅能水解乳糖生成半乳糖和葡萄糖,而且具有转糖基活性,是一种重要的糖苷水解酶,在食品、医药和分析化学等领域都有重要应用。近年来随着糖生物学的发展,转糖基β-半乳糖苷酶逐渐成为糖类合成的重要工具酶,被用于合成各种糖基化合物,乳果糖、低聚半乳糖就是其中比较突出的两种。本课题旨在从自然界筛选得到一株水解活力较高、兼具转糖基活性、生长发育良好的β-半乳糖苷酶产生菌株,对其进行菌种鉴定,紧接着从基因克隆、基因表达、重组菌诱导表达条件优化、重组酶酶学性质研究以及酶法合成低聚糖等方面进行系统研究,进而为其在功能性低聚糖生产领域的应用打下一定基础。通过四级筛选,从自然界中得到一株水解活力相对较高、兼具转糖基活性、生长发育良好的β-半乳糖苷酶产生菌株,借助菌落形态观察、生化指标测定以及16S rDNA序列分析,鉴定其为Klebsiella pneumoniae 285。通过单因子试验和正交试验对Klebsiella pneumoniae 285产酶条件进行优化,得到最佳培养基组成为乳糖50g/L,蛋白胨20g/L,酵母浸膏10g/L,氯化钠3g/L；最优发酵条件为种龄6h,起始pH7.0,接种量3%,装液量40mL/250mL,30℃下发酵8h。最优条件下产酶活力为7.21U/mL。以乳糖为底物Klebsiella pneumoniae 285β-半乳糖苷酶催化生成低聚糖,反应液组分包括果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、低聚糖(包括转移二糖、低聚三糖)。反应液总糖中,葡萄糖占9.7%,乳糖占26.9%,低聚糖占53.7%。以乳糖、果糖为底物时,反应液总糖中,果糖占21.4%,葡萄糖占5.1%,乳糖占23.4%,低聚糖占45.0%。PCR扩增Klebsiella pneumoniae 285β-半乳糖苷酶编码基因,构建DH5α/pMD18-T-bgaB以及DH5α/pMD18-T-LacZ两株克隆菌株,委托测序,结果表明两段序列与已报道的不同亚种对应序列的同源性均极高。成功构建BL21/pET-28a(+)-bgaB以及BL21/pET-28a(+)-LacZ两株表达菌株,同时实现酶活表达。通过单因素试验对两株重组菌的诱导表达条件进行优化,结果得到BL21/pET-28a(+)-bgaB重组菌的最佳诱导条件为诱导时机135min、IPTG浓度0.2mmol/L、诱导长度8h; BL21/pET-28a(+)-LacZ重组菌的最佳诱导条件为诱导时机120min、IPTG浓度0.6mmol/L、诱导长度9h。用金属镍螯合琼脂糖凝胶层析柱分离纯化带(His)6标签的重组酶,得到两种重组酶的最适咪唑洗脱浓度均为350mmol/L,电泳检测均获得单一条带。纯化后bgaB重组β-半乳糖苷酶的比酶活为185.45U/mg,是纯化前比酶活的92.46倍；纯化后LacZ重组β-半乳糖苷酶的比酶活为62.05U/mg,是纯化前比酶活的9.09倍。酶学性质研究表明,bgaB重组β-半乳糖苷酶的最适作用温度为50℃,40℃、50℃下均呈现良好的稳定性；最适作用pH为8.0,在pH7.5-9.0范围内呈现良好的稳定性；金属离子Cu2+和螯合剂EDTA二钠对酶活有明显的抑制作用,其它离子对酶活影响不大甚至呈现一定的激活作用。LacZ重组β-半乳糖苷酶的最适作用温度为40℃,40℃、50℃下均呈现良好的稳定性；最适作用pH为7.5,在pH7.5-9.0范围内呈现良好的稳定性；金属离子Pb2+、Cu2+和螯合剂EDTA二钠对酶活有一定的抑制作用,其它离子对酶活影响不大甚至呈现相当的激活作用。动力学参数测定表明,bgaB重组β-半乳糖苷酶的Vmax为227.27μmol/(mg protein·min),Km为0.82mmol/L; LacZ重组β-半乳糖苷酶的Vmax为58.82μmol/(mg protein·min),Km为0.72mmol/L。以乳糖为底物重组β-半乳糖苷酶催化生成低聚糖,选用bgaB重组β-半乳糖苷酶时,反应液总糖中,葡萄糖占6.3%,乳糖占45.2%,低聚糖占42.3%；选用LacZ重组β-半乳糖苷酶时,葡萄糖占12.8%,乳糖占14.1%,低聚糖占60.4%。以乳糖、果糖为底物重组β-半乳糖苷酶催化生成低聚糖,选用bgaB重组β-半乳糖苷酶时,反应液总糖中,果糖占21.2%,葡萄糖占2.8%,乳糖占28.3%,低聚糖占44.9%；选用LacZ重组β-半乳糖苷酶时,果糖占21.5%,葡萄糖占11.7%,乳糖占8.9%,低聚糖占46.4%。