恶性肿瘤严重的威胁着人类生命和健康,其发病率和死亡率在世界许多国家和地区居首位。据WHO预测,到2020年全球肿瘤发病率将上升50%,癌症病人将增加的近1500万,恶性肿瘤将成为21世纪危害人类健康的头号杀手。此外,在过去的二十年中,仅我国每年就有新增癌症患者180万,死亡120万,且呈急剧上升的趋势。恶性肿瘤是病因、病理、临床表现以及治疗均比较复杂的一类常见病、多发病,所以彻底征服癌症是全球性医药卫生工作的一项艰巨任务。抗癌药物是肿瘤治疗的主要手段之一,近年来世界各国相继研制开发了不少疗效较好的抗癌新药,但这些药物多价格昂贵,且具有较大副作用或长期应用易引起耐药。由于中医药在治疗癌症方面有其独到之处,近年来,从中药中筛选抗癌活性成分以及抗癌先导化合物已成为这一领域研究的热点。据不完全统计,来源于植物药的抗癌制剂,占总抗癌药的32.25%。紫杉醇、喜树碱、长春新碱等已作为许多肿瘤的首选药。我国的药用植物种质资源丰富,如果能将中药中抗肿瘤有效成分分离出来,明确其抗肿瘤作用及机理,对于抗肿瘤药物的研制开发以及肿瘤治疗具有非常重要的意义。青龙衣是胡桃科胡桃属植物胡桃楸Juglands mandshurica Maxim.和核桃J.ragia L.未成熟果实的外果皮。现代药用研究表明青龙衣药理作用广泛,具有抗炎、镇痛、抗菌和抗肿瘤等作用,特别是抗肿瘤作用尤为显著,已被人们普遍认同。目前国内外对青龙衣的化学成分研究较少,无论是实验研究还是临床应用均停留在粗提物阶段,抗肿瘤物质不明确,限制了其药理机制的研究及进一步的临床应用。为了阐明青龙衣的抗肿瘤活性成分及其机制,本论文主要从以下三个方面进行研究：一采用体外活性筛选的方法筛选出青龙衣乙醇提取物的抗肿瘤活性部位,对活性相对强的乙酸乙酯部位进行系统分离,筛选出抗肿瘤活性成分胡桃醌,并建立胡桃醌的提取、分离和纯化的方法和工艺。二运用体内外实验确认胡桃醌的抗肿瘤作用,进一步运用体外实验证明其具有诱导肿瘤凋亡及周期阻滞作用。三运用体外实验探讨胡桃醌诱导肿瘤细胞凋亡和周期阻滞的分子机制,以期发现抗肿瘤作用的作用靶点,为萘醌类成分抗肿瘤药物研发和临床应用提供重要的理论指导和实验依据。1青龙衣抗肿瘤活性成分筛选1.1青龙衣4个萃取部位抗肿瘤活性研究目的：研究青龙衣乙醇提取物的4个溶剂萃取部位对肿瘤细胞的体外抑制作用,筛选青龙衣抗肿瘤活性部位。方法：采用乙醇为提取溶剂,运用超声法提取青龙衣药材,药渣继续用热回流提取,合并提取液,浓缩。挥至无醇味时加水溶解,水溶液依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取,各部分萃取液浓缩至干膏状。采用MTT法,选用四种细胞株(人胃癌细胞株SGC-7901,人肝癌细胞株HepG2,人肺腺癌细胞株A549,乳腺癌细胞株MCF7)进行体外实验,对各萃取部位进行抗肿瘤活性筛选。结果：青龙衣的石油醚萃取部位、氯仿萃取部位、乙酸乙酯萃取部位对各肿瘤细胞都有不同程度的抑制作用。其中石油醚部位对SGC-7901、HepG2、A549、MCF7的ICso分别为(70.43±2.51)μg/mL, (97.05±2.21)μg/mL, (29.42±1.77)μg/mL, (198.72±12.37)μg/mL;氯仿部位对SGC-7901、HepG2、A549、MCF7的IC50分别为(58.35±1.83)μg/mL, (45.31±1.25)μg/mL, (24.86±1.67)μg/mL (59.19±3.86)μg/mL;乙酸乙酯部位对SGC-7901、HepG2、A549、MCF7的IC50分别为(51.86±1.16)μg/mL, (28.09±0.69)μg/mL, (25.82±1.51)μg/mL (47.84±0.80)μg/mL;正丁醇部位对4株细胞的IC50均在100μg/mL以上,抗肿瘤作用不明显；水溶性部位对肿瘤细胞无抑制作用。结论：青龙衣乙醇提取物的石油醚部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位初步确定为青龙衣抗肿瘤活性部位。乙酸乙酯部位抗肿瘤活性相对最强。1.2青龙衣乙酸乙酯部位化学成分研究目的：对青龙衣乙酸乙酯部位的化学成分进行研究。方法：利用硅胶柱层析进行分离纯化,根据化合物的理化性质,光谱数据以及文献核对等手段进行结构鉴定。结果：分离并鉴定了6个化合物,分别为胡桃醌(1),p-谷甾醇(2),齐墩果酸(3),香草醛(4),香草酸(5),槲皮素(6)。结论：共得到6个化合物,以上化合物均为已知化合物。1.3青龙衣乙酸乙酯部位抗肿瘤活性成分的体外筛选目的：评价青龙衣乙酸乙酯部位分离得到的6个化合物的抗肿瘤活性。方法：采用MTT法对6个化合物进行抗肿瘤活性筛选。结果：胡桃醌对4株肿瘤细胞有很强的增殖抑制作用,IC50分别为(21.20±0.56)μmol/L、(34.70±0.91)μmol/L、(24.80±0.65)μmol/L、(25.47±0.67)μmol/L;槲皮素对4株肿瘤细胞有一定的增殖抑制作用,IC50分别为(53.61±1.41)μmol/L. (47.81±1.26)μmol/L.(57.16±1.51)μmol/L.(54.56±1.44)μmol/L；齐墩果酸、香草酸对个别肿瘤细胞有一定的作用,抗肿瘤活性须进一步证实β-谷甾醇、香草醛对4株肿瘤细胞没有生长抑制作用。结论：胡桃醌抗肿瘤活性显著,其抗肿瘤作用及机制值得进一步研究。1.4青龙衣中胡桃醌的提取分离目的：研究从青龙衣中提取、分离和纯化胡桃醌的方法。方法：以胡桃醌为考察指标,采用高效液相色谱法对青龙衣的贮藏年限、采收时间、采制方法及最佳提取方法和提取溶剂进行研究。运用硅胶柱层析对目标化合物胡桃醌进行分离,半制备高效液相色谱进行纯化,采用高效液相色谱仪测定胡桃醌.的纯度。结果：青龙衣适宜的采收时间是7-8月份果实未成熟时采收,青龙衣宜采用阴干的方法干燥。青龙衣药材不易贮藏过长时间,应该尽量应用当年的药材。乙酸乙酯为青龙衣中胡桃醌的最佳提取溶剂,超声法和冷浸法为青龙衣中胡桃醌提取的适宜方法。胡桃醌的分离工艺为青龙衣乙酸乙酯提取物经硅胶柱层析,以氯仿-甲醇梯度洗脱,TLC跟踪检识,合并含萘醌类成分的洗脱液相同组分。将该相同组分经硅胶吸附柱层析,石油醚-乙酸乙酯(200：1)洗脱得到胡桃醌粗品。采用半制备高效液相色谱进行纯化。制备的胡桃醌的纯度为98.23%,转移率为10.41%。结论：根据胡桃醌的理化性质确定的提取和分离方法简单易行,转移率高,适合实验室制备及放大生产。2胡桃醌体内外抗肿瘤作用研究2.1胡桃醌体内抗肿瘤作用研究目的：研究胡桃醌的体内抗肿瘤作用。方法：建立小鼠S180肉瘤模型,考察胡桃醌的体内抑瘤作用；HE染色后光镜观察肿瘤组织生长及病理变化；采用透射电镜观察肿瘤细胞超微结构改变；FCM检测S180实体瘤细胞的凋亡情况；建立小鼠H22肝癌腹水瘤模型,考察胡桃醌对H22荷瘤小鼠生存时间的影响。结果：胡桃醌对S180实体瘤生长具有良好的抑制作用,胡桃醌8μmol/kg剂量组抑瘤率达到(48.97±3.27)%。胡桃醌各组瘤重与空白对照组比较均显著降低(P<0.01);光学显微镜下,胡桃醌组S180实体瘤坏死呈多发性,与空白对照组比较有明显改变；电子显微镜下,胡桃醌组S180细胞核物质凝集、集边,凋亡小体形成。FCM结果显示直方图中有亚二倍体峰出现,凋亡率的增加呈剂量依赖关系,胡桃醌8μmol/kg剂量组诱导细胞凋亡率最高,达(10.27±1.05)%；胡桃醌可显著延长H22荷瘤小鼠的生存时间,胡桃醌各剂量组的生命延长率均大于75%。结论：胡桃醌在体内具有较好的抗肿瘤作用,并能诱导肿瘤细胞凋亡。2.2胡桃醌诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡及细胞周期阻滞作用研究目的：研究胡桃醌对人胃癌SGC-7901细胞的凋亡诱导作用及细胞周期阻滞作用。方法：采用SRB法考察胡桃醌对人胃癌SGC-7901细胞的生长抑制作用；采用荧光显微镜观察SGC-7901细胞凋亡形态；采用透射电子显微镜观察SGC-7901细胞超微结构的改变；采用Annexin V－FITC/PI双染,激光共聚焦显微镜观察细胞的早期凋亡情况,FCM检测SGC-7901细胞凋亡率；采用PI单染,流式细胞仪分析胡桃醌对SGC-7901细胞周期的影响。结果：胡桃醌具有明显的抑制SGC-7901细胞生长的作用,药物作用72 h后,SRB法测得胡桃醌对SGC-7901细胞的GI5o为(21.26±0.26)μmol/L,TGI为(78.11±3.55)μmol/L；荧光显微镜下显示,胡桃醌作用72 h后随着胡桃醌浓度的增加,细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒状荧光,细胞的凋亡小体逐渐增多。电子显微镜下显示,胡桃醌作用72h后,出现细胞微绒毛消失,细胞核内染色质固缩、集边,形成凋亡小体等一系列特征性的凋亡形态学改变；激光共聚焦显微镜观察发现,胡桃醌作用48h后,低剂量时细胞就已经有早期凋亡,随着胡桃醌浓度的增加,发生凋亡的细胞也逐渐增多；流式细胞仪测得随着胡桃醌浓度的增加凋亡率也增加,20μmol/L胡桃醌处理48h的凋亡率为(27.60±0.70)%；细胞周期分析结果表明不同浓度的胡桃醌(5,10,15,20μmol/L)作用48h后,G1期细胞比例降低,S期细胞比例升高,呈现明显的S期阻滞作用。结论：胡桃醌能显著抑制SGC-7901细胞增殖,诱导SGC-7901细胞凋亡并将细胞阻滞于S期。3胡桃醌诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡和S期阻滞的机制研究3.1胡桃醌诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡的机制研究目的：研究胡桃醌诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡的分子机制。方法：采用流式细胞仪检测胡桃醌对人胃癌SGC-7901细胞内活性氧水平的影响；Fluo3-AM双染,激光共聚焦显微镜检测胡桃醌对SGC-7901细胞内Ca2+浓度的影响；采用Western blot法检测胡桃醌对SGC-7901细胞Bcl-2和Bax蛋白表达的影响；采用流式细胞仪测定胡桃醌对SGC-7901细胞线粒体膜电位的影响及对Cytochrome C蛋白表达的影响；采用酶活性检测试剂盒测定SGC-7901细胞细胞内Caspase-3的活性。结果：胡桃醌作用48h后,5-20μmol/L的胡桃醌给药组的ROS水平分别为(34.83±1.45)%、(42.43±1.36)%、(53.73±1.38)%、(68.67±1.33)%,与空白对照组比较有显著性差异(P<0.01)。胡桃醌作用48h后,与空白对照组相比,随着胡桃醌浓度的增加细胞内的Ca2+浓度显著升高(P<0.01),细胞内的Ca2+浓度与药物浓度呈剂量依赖性。胡桃醌各剂量组Bcl-2蛋白表达量随着给药浓度的升高而降低,Bcl-2蛋白表达量与胡桃醌浓度呈负相关；胡桃醌各剂量组Bax蛋白表达量随着给药浓度的升高而升高,Bax蛋白表达量与胡桃醌浓度呈正相关。胡桃醌有降低线粒体膜电位的作用,5-20μmol/L的胡桃醌给药组的线粒体膜电位分别降低为(85.53±1.82)%、(53.57±2.48)%、(46.33±1.46)%、(36.43±2.64)%,与空白对照组比较有显著性差异(P<0.01)。胡桃醌各剂量组胞浆Cytochrome C蛋白表达量随着给药浓度的升高而升高,Cytochrome C蛋白表达量与胡桃醌浓度呈正相关。胡桃醌作用48 h后,随着胡桃醌浓度的增加Caspase-3的相对活性逐渐升高,5-20μmol/L胡桃醌给药组Caspase-3的酶活力单位分别为5.44±0.48,5.65±0.79,7.00±0.83,10.44±0.63。结论：胡桃醌通过线粒体途径诱导SGC-7901细胞凋亡。胡桃醌诱导肿瘤细胞凋亡的机制是一方面通过降低Bcl-2蛋白的表达,增加Bax蛋白的表达,从而促进MPTP孔开放,降低线粒体膜电位；另一方面通过升高细胞内ROS水平,促进细胞内Ca2+浓度升高,使线粒体Ca2+超载,降低线粒体膜电位,并且ROS水平升高可诱导MPTP孔开放,使线粒体膜电位降低。线粒体膜电位的降低将促使线粒体产生更多的ROS,线粒体受到更严重损伤,使线粒体中的Ca2+等线粒体内容物流入胞浆中。同时,线粒体膜电位的降低将导致线粒体膜内相对高渗,线粒体基质膨胀,外膜破裂,释放出Cytochrome C。Cytochrome C释放入胞质后,激活Caspase级联反应,最终导致Caspase-3的活化并诱导细胞凋亡。3.2胡桃醌诱导SGC-7901细胞S期阻滞的机制研究目的：研究胡桃醌诱导SGC-7901细胞S期阻滞的分子机制。方法：采用Western Blot法测定胡桃醌对CHK2、CDK2、Cdc25A和p-Cdc25A等S期相关蛋白表达的影响。结果：胡桃醌能够上调SGC-7901细胞中的CHK2蛋白的表达,下调CDK2蛋白的表达,呈剂量依赖性。SGC-7901细胞中的Cdc25A蛋白表达水平与胡桃醌的剂量呈负相关,而p-Cdc25A蛋白表达水平与胡桃醌的剂量呈正相关。结论：胡桃醌引起SGC-7901细胞S期阻滞的机制可能是胡桃醌引起细胞DNA损伤,使CHK2蛋白被激活。激活的CHK2蛋白使下游靶分子蛋白Cdc25A磷酸化而失活。失活的Cdc25A不能使CDK2的Tyr15去磷酸化,从而下调CDK2的活性,使其启动和推动S期进展的作用丧失,导致SGC-7901细胞S期阻滞。结论青龙衣乙醇提取物的石油醚部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位初步确定为青龙衣抗肿瘤活性部位,其中乙酸乙酯部位的活性最强。从乙酸乙酯层分离出6个化合物,分别为胡桃醌,p-谷甾醇,齐墩果酸,香草酸,槲皮素和香草醛,均为已知化合物。其中槲皮素和胡桃醌有良好的抗肿瘤活性。胡桃醌抗肿瘤作用最显著,人胃癌SGC-7901细胞对为胡桃醌的细胞毒作用最为敏感。以乙酸乙酯为提取溶剂,采用冷浸法和超声法提取青龙衣,利用硅胶柱层析分离得胡桃醌粗品。进一步采用半制备高效液相色谱进行纯化,可得到纯度为98.23%的胡桃醌,转移率为10.41%。青龙衣药材的要求：不易贮藏过长时间,尽量应用当年的药材,7～8月份果实未成熟时采收,阴干或和晒干。体内外实验结果表明胡桃醌具有良好的抗肿瘤作用。胡桃醌可能通过诱导肿瘤细胞凋亡和周期阻滞起到抗肿瘤作用。胡桃醌一方面通过提高细胞内活性氧水平,影响Bcl-2、Bax蛋白表达,进而通过线粒体途径诱导细胞凋亡,另一方面胡桃醌引起细胞DNA损伤,通过ATM-CHK2-Cdc25A-CDK2调控途径诱导肿瘤细胞发生S期阻滞。本研究的创新点1.应用体外生物活性靶向筛选确定青龙衣的抗肿瘤有效部位及化合物,明确了青龙衣的药效物质基础。2.建立青龙衣中不稳定的萘醌类成分——胡桃醌的提取、分离和纯化工艺,所得胡桃醌化合物纯度及提取率均高于以往报道。3.阐明胡桃醌通过线粒体途径诱导SGC-7901细胞凋亡。4.阐明胡桃醌通过ATM-CHK2-Cdc25A-CDK2调控途径诱导SGC-7901细胞发生S期阻滞。