山羊痘（Goatpox,GTP）是由山羊痘病毒（Goatpox virus,GTPV）引起的一种急性、热性、高度接触性的传染病。GTPV主要感染山羊,感染的羊只表现为食欲减退、体温升高、皮肤和黏膜处出现痘疹,造成机体免疫力下降。如果期间发生继发感染,可直接导致羊只死亡,给养羊业造成了巨大的经济损失。有报道称山羊痘能够感染人类,说明该病具有潜在的公共卫生危害。G9蛋白是痘苗病毒入侵宿主细胞相关的膜蛋白,其功能和抗原性预示着G9蛋白可用于诊断方法开发的潜在价值。本研究以GTPV G9为研究对象,应用生物信息学方法对G9蛋白的结构和功能进行了分析,通过体外表达系统表达并纯化得到了纯度较高的重组G9蛋白,随之,鉴定了其生物活性并建立了间接ELISA检测方法,为GTPV特异、灵敏、便捷的诊断技术奠定基础。1、G9基因的克隆和生物信息学分析通过PCR克隆获得了 GTPV中编码G9蛋白的基因序列,并进行了测序确认。利用生物信息学技术对G9基因的核酸序列和翻译的蛋白序列进行预测分析。结果显示,G9蛋白的理论等电点为7.39,在二级结构中以α-螺旋和无规则卷曲为主,分别占36.61%和42.86%,具有17个抗原表位位点,包含34个磷酸化位点,在蛋白序列末尾有跨膜区域。在其三级结构的预测中发现具有参与细胞凋亡和跨膜功能的结构域。2、G9蛋白的原核表达及纯化鉴定构建重组质粒载体pET-30a-G9并转化到菌株BL21中诱导表达重组G9蛋白,通过摸索诱导剂浓度和诱导时间,确定最优的表达条件。经SDS-PAGE分析,重组G9蛋白表达成功,蛋白大小为39kDa,其主要以包涵体形式存在。Western blot试验证明重组G9蛋白具有良好的反应原性。3、基于重组G9蛋白的间接ELISA方法的建立利用纯化的重组G9蛋白做为包被抗原,建立ELISA方法并确定了重组蛋白最佳包被量为每孔100ng;一抗血清稀释为1:80;抗原孵育时间2h;封闭时间为1.5 h;一抗血清孵育时间为1h;酶标二抗稀释倍数为1:10000;酶标二抗孵育时间为1h。确定临界值OD450mm≥0.251时,判定为阳性;<0.204时,判定为阴性;0.25>OD450nm>0.204时,判定为可疑,需重新检测;自建ELISA方法检测副结核分支杆菌、口蹄疫病毒、小反刍兽疫病毒、布鲁氏菌等羊痘常见病源的阳性血清结果分别为0.066、0.052、0.048、0.059,无交叉反应,说明其特异性较强;GTPV阳性山羊血清稀释到1:320检测的OD450nm值为0.386,表明该方法有较高的敏感性;批内、批间重复试验的变异系数均不大于10%,与商品化ELISA检测试剂盒的样本检测阳性符合率为88.9%,阴性符合率为97.3%,总符合率为97.8%。说明建立的间接ELISA检测方法准确性较高。应用生物信息学技术分析山羊痘病毒G9蛋白的独特的表位和结构,获得反应原性良好的重组蛋白,并成功建立了间接ELISA方法,为建山羊痘的准确诊断提供了有力工具。