凋亡而引起的神经元丢失是神经退行性疾病如帕金森病和老年性痴呆症的主要病理特征。阐明对神经元凋亡起关键性作用的蛋白质及其信号转导机制，对揭示神经退行性疾病发生的本质并寻找、确立药物靶点，从而进一步达到有效防治神经退行性疾病的目的，具有至关重要的意义。 JNK/c-Jun通路在多种神经元凋亡模型中激活，如撤NGF处理的交感神经元，撤钾处理的小脑颗粒神经元，β淀粉样蛋白处理大脑皮质神经元及MPTP引起的黑质多巴胺神经元。阻断JNK/c-Jun通路活性可以保护神经元免于凋亡，显示JNK/c-Jun通路为神经元凋亡所必需。直接阻断转录因子c-Jun的活性可以很好的保护神经元，提示c-Jun触发一些靶基因的表达进而介导凋亡。然而，目前c-Jun促凋亡靶基因是什么并不清楚。本实验室用基因芯片技术筛选到一系列c-Jun候选靶基因(此部分工作在今年毕业的应春怡博士生的毕业论文中做了详细叙述)，并且已经对其中一个候选靶基因Dp5进行了深入研究(研究成果发表在J Biol Chem．上)。在对JNK/c-Jun通路研究的工作基础上，论文就另一可能被此通路调控的基因puma/Bbc3(1253 upregulated modulator of apoptosis/Bcl2 binding components 3)做一些探讨。 神经元凋亡的发生是通过线粒体凋亡通路所介导。各种凋亡刺激作用引起线粒体外膜通透性增加，细胞色素e、AIF等促凋亡物释放，进而激活凋亡杀手 Caspase引起凋亡发生。Bcl2家族成员在维持线粒体外膜的完整性、调节细胞色素C的释放这一过程中起到关键作用。Bcl2家族成员大致可以分成三大类，抗凋亡Bcl2家族成员如Bcl2，BclXL,MCL1，它们含有BHl-4结构域；含有BHl-4结构域的促凋亡家族成员如BAX，BAK激活后构型发生变化形成寡聚体在线粒体外膜上形成孔道使其通透性增加；第三类是只含BH3结构域的BH3-only蛋白家族成员，包括dp5，puma，bim，noxa，bmf等。BH3-only蛋白通过蛋白质相互作用阻断抗Bcl2抗凋亡蛋白成员从而解除对BAX的抑制作用，或直接与BAX作用激活其功能。因此BH3-only蛋白被称为凋亡的启动者，在凋亡的发生中发挥重要的调控作用。 puma是在2001年发现的BH3-only蛋白家族成员，已经证实其在多种细胞系的凋亡过程中起到重要作用。实验发现过表达puma在血清等促存活因子存在的情况下即可诱发神经元凋亡；敲除或干扰puma可有效阻止多种凋亡刺激引起的神经元凋亡，表明puma在神经元凋亡中发挥重要的作用。 puma基因是作为p53的促凋亡靶基因被发现的。长期以来p53作为促发细胞凋亡的转录因子，其靶基因一直不清楚。在2001年有文章指出，p53正是通过puma介导结肠癌细胞凋亡。其后，大量文章报道puma为p53促凋亡靶基因。直到2005年有研究表明过表达转录因子e2fl能使puma表达上调，这就提示了puma可能还受其他转录因子的调控。事实上，在多个p53非依赖的细胞凋亡模型中，puma仍发挥重要作用，这就说明多种信号通路参与puma基因的表达调控。在小脑颗粒神经元(cerebellar granule neurons，CGNs)撤钾凋亡这一经典的中枢神经元凋亡模型中已发现puma蛋白表达上调，而敲除p53后并不影响凋亡的进程，说明在此模型中puma的表达可能是p53非依赖的。而在交感神经元撤NGF凋亡这一经典的外周神经元凋亡模型中，c-JWl突变体的神经元中puma蛋白表达不如正常的高，提示puma可能为转录因子c-Jun的靶基因。在此背景下，本课题对撤钾诱导小脑颗粒神经元凋亡时‘puma的转录调控进行研究。 本课题主要回答以下问题： 1．撤钾诱导CGNs凋亡时puma mRNA是否表达上调? 2．p53在此凋亡过程中转录激活上调了吗? 3．JNK/c-Jun通路在此凋亡过程中被激活了吗? 4．假如上述通路被激活了，这种激活介导了puma的转录吗? 5．puma能否促发神经元凋亡? 结果： 1、撤钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡模型中puma mRNA表达增加体外培养第7天小脑颗粒神经元(DIV7 CGNs)，分别用25 mM KCl(25 K)或5 mM KCl(5 K)培养基处理1、2、4、6小时。收mRNA后做Q-PCR发现1小时后puma mRNA开始升高，并在后续时间点持续增加。 2、p53的转录活性没有被激活收集0、2、4、8、12小时的蛋白，做Western blot检测p53的表达量，发现所有时间点p53蛋白量并没有改变。用对p53转录活性具有特异反应性的报道基因检测凋亡模型，发现该报道基因在凋亡时没有反应性。所以在此凋亡过程中，p53的转录活性并没有激活。 3、JNK/c-Jun通路被激活收集时间点1、2、4小时的蛋白后用磷酸化特异的JNK抗体检测JNK是否激活。发现，撤钾处理1小时后JNK磷酸化水平就显著增加，并在后续检测的时间点持续增加，显示JNK通路激活。同一张膜Stripping后检测JNK总蛋白，显示JNK蛋白质总量保持一致，JNK磷酸化信号的增加不是因为蛋白上样量的差异而造成。为了进一步检测JNK活性，我们用c-Jun磷酸化抗体(Ser73)检测了JNK底物c-Jun磷酸化水平的变化。发现c-Jun磷酸化水平在撤钾1小时后显著增加，与JNK磷酸化变化趋势基本一致。说明JNK/c-Jun通路被激活。 4、JNK活性介导了puma表达上调接下来我们阻断JNK活性观察puma表达变化。DIV7 CGNs分别用25 K，5K或5K加入MLK抑制剂CEPl1004处理4小时后提取RNA，用Q-PCR方法检测puma mRNA水平。结果发现，CEPl1004可完全阻断撤钾引起的c-JunmRNA水平增加，显示CEPl1004阻断JNK活性。puma mRNA的上调可被CEPl 1004显著但不完全抑制(～60﹪)。不完全抑制不是由于抑制量不足造成，因为此时JNK活性已完全被阻断(c-Jun mRNA增加被完全抑制)。为进一步明确JNK在puma mRNA表达调控中的作用，我们用SP600125直接抑制JNK活性。SP600125也明显抑制撤钾引起的puma mRNA增加(～66﹪)，与CEPl1004的结果相一致。我们的结果表明JNK介导puma mRNA表达上调，但同时也存在其他通路参与Dp5表达调控。 5、直接阻断e-Jun活性抑制puma诱导表达为了研究c-Jun是否参与puma表达调控，我们直接阻断c-Jun转录活性观察puma表达变化。c-Jun负显性突变体△169(截去c-Jun N末端168个氨基酸，去除了转录激活区而保留DNA结合区)可以竞争性结合c-Jun的DNA结合位点从而发挥抑制c-Jun转录活性的功能。用Ad-A169把△169导入神经元。DIV5 CGNs感染Ad-GFP或．Ad-A169(MOI=100)36小时后，25 K、5 K处量4小时。用Q-PCR的方法检测puma表达变化。发现感染Ad-GFP的神经元5 K处理后puma mRNA水平显著上调，表明腺病毒本身本不会干预puma．基因的表达上调。而感染Ad-△169后，puma mRNA表达上调可被明显抑制(～57﹪)。我们的结果表明c-Jun介导puma的表达上调。 6、过表达puma促发神经元凋亡我们过表达了puma，发现其在存活因子存在的情况下即可引起神经元凋亡，显示其具有很强的促神经元凋亡功能。 结论： 撤钾诱导体外培养的小脑颗粒神经元凋亡时： 1．Q-PCR显示puma基因的升高具有时效关系，puma被诱导上调； 2．Western blot、报道基因结果显示p53转录活性没有被激活，p53转录活性不参与puma的表达； 3．JNK/c-Jun通路被激活且其通路抑制剂和Ad-△169均能有效抑制puma的表达， JNK/c-Jun通路介导了puma的表达。