γ-聚谷氨酸/壳聚糖复合水凝胶的制备及其软骨细胞相容性的检测

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水凝胶是通过多种交联技术形成的一种三维(3D)网络结构的亲水性聚合物材料,具有在其结构间隙吸收和保持大量水的能力。因其特殊性能,如高含水率、三维网络结构、易于负载生长因子以及独特的分子结构和优异的生物相容性等优势,目前在组织支架、软骨修补、药物释放、伤口敷料、可穿戴设备等应用领域获得广泛关注。本文主要研究内容如下:首先,选用了两种具有良好相容性的原材料:γ-聚谷氨酸(γ-PGA)与脱羧化壳聚糖(CS),采用了1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)交联法制备了γ-PGA/CS复合水凝胶,并通过冷冻干燥法制备了细胞支架材料。其次,采用了倒置小瓶法判定复合水凝胶的临界成胶浓度为γ-PGA/CS=3:1,接着采用了衰减全反射-傅里叶红外(ATR-FTIR)、X-射线衍射(XRD)、扫描电子显微镜(SEM)、旋转流变仪、密度及孔隙率、溶胀与体外降解等实验技术和方法,对于γ-PGA/CS复合水凝胶的离子络合作用、孔径大小、机械性能、密度与孔隙率大小以及溶胀与降解等性能进行了探究。ATR-FTIR研究结果表明:不同浓度的γ-PGA/CS复合水凝胶都在1205 cm-1处出现了峰,但在γ-PGA和CS中并没有观察到。推测可能是由于γ-PGA和CS之间存在着离子络合物的相互作用所导致的。XRD研究结果表明:CS衍射图中出现了两个较强峰,而γ-PGA与γ-PGA/CS复合水凝胶衍射图中却没有明显峰,因此,我们推测,γ-PGA与CS之间形成离子络合物相互作用破坏了CS内部原有的晶体结构。SEM研究结果表明:每组γ-PGA/CS复合水凝胶都形成了均匀的多孔结构,呈现出明显的三维网络,孔径大小在85.5±4.0μm与142.3±7.8μm之间,随着浓度不断增大孔径逐渐减小。剪切流变实验结果表明:400%的应变力之前,储能模量(G’)基本保持不变,推测主要是因为γ-PGA/CS复合水凝胶具有稳定的三维结构。在0.1~100 rad/s的范围内,储能模量(G’)始终大于损耗模量(G’’),说明水凝胶有良好的刚性和韧性。密度及孔隙率研究结果表明:浓度为γ-PGA:CS=3:1水凝胶的密度最小,孔隙率最大;浓度为γ-PGA:CS=12:1水凝胶的密度最大,孔隙率最小。溶胀与体外降解研究结果表明:复合水凝胶表现出明显溶胀性能,4 h内达到平衡。七天内,大部分浓度的水凝胶仍能够保持在原本重量的65%以上,说明γ-PGA/CS复合水凝胶支架在常规温度的情况下,具有保持水分不流失的能力。最后,为了验证γ-PGA/CS复合水凝胶的细胞相容性,将γ-PGA/CS复合水凝胶分别与293T细胞、软骨细胞共培养,使用CCK-8法、活死细胞染色法以及激发共聚焦显微镜等手段对细胞相容性进行探究。CCK-8法研究结果表明:随着时间的增加吸光度也在不断增加,说明γ-PGA/CS复合水凝胶能够促进两种细胞的增殖。活/死细胞染色研究结果表明:各个组别水凝胶浸提液所培养的两种细胞均具有良好细胞活性。激发共聚焦3D扫描研究结果表明:两种细胞在复合水凝胶支架材料中均匀分布,随时间增加细胞量增加,说明细胞能够在3D复合水凝胶中进行有效增殖与粘附。接着采用实时荧光定量PCR验证了复合水凝胶是否能够维持软骨细胞表型。实时荧光定量PCR研究结果表明:Rho A、Co L2a、COMP、SOX9四种基因在γ-PGA:CS=4:1、6:1两种浓度水凝胶中的表达量均高于对照组。表明γ-PGA/CS复合水凝胶在维持软骨细胞的合成细胞外基质表型方面有一定的促进作用。其中γ-PGA:CS=6:1浓度的水凝胶的作用效果更为显著。最后,将γ-PGA/CS复合水凝胶包埋于C57BL小鼠体内,探究了复合水凝胶在小鼠体内的降解行为。体内降解实验研究结果表明:20天时皮下包埋的γ-PGA/CS复合水凝胶支架已经基本完全降解,并且周围组织平滑,无明显红肿,整个过程中未发现其它并发症,证明γ-PGA/CS复合水凝胶支架材料也具有良好的体内相容性。本研究中通过离子相互作用所制备的γ-PGA/CS复合水凝胶支架材料具有良好的机械性能,细胞相容实验证实其具有良好的相容性,体内降解实验表明具有良好体内相容性,为之后γ-PGA/CS复合水凝胶支架作为一种生物医用材料的研发提供了一定的理论依据。
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