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研究目的:通过IgE(Immunoglobulin E,免疫球蛋白E)和C48/80(Compound48/80,化合物48/80)两种方式诱导RBL-2H3(Rat basophilic leukemia cell line,大鼠嗜碱性细胞白血病细胞)活化脱颗粒,建立起体外细胞脱颗粒模型。研究中药单体BAI(Baicalein,黄芩素)在体外实验中对细胞脱颗粒模型的影响,并探讨其抑制Ⅰ型超敏反应的分子调节机制。研究方法:体外培养RBL-2H3细胞株,绘制细胞生长曲线,确定合适的培养条件。使用IgE和C48/80两种方式诱导RBL-2H3细胞活化脱颗粒,建立起体外细胞脱颗粒模型。采用CCK8(Cell Counting Kit-8)法和细胞凋亡检测实验(Annexin V/PI双染色法)检测BAI在3.125-100.000μM的浓度范围内对细胞增殖活性的影响,以及在50-200μM的浓度范围内对细胞诱导凋亡作用的影响。不同浓度BAI作用细胞后,按照造模条件激发细胞脱颗粒,光学显微镜下观察细胞形态;应用ELISA(enzyme-linked immuno sorbent assay,酶联免疫吸附剂测定)方法检测细胞上清液中β-HEX(β-hexosaminidase,β-氨基己糖苷酶)、HIS(Histamine,组胺)、IL-4(Interleukin-4,白介素-4)和TNF-α(Tumor necrosis factor-α,肿瘤坏死因子-α)水平;应用q-PCR(Real-time Quantitative PCR Detecting System,实时荧光定量核酸扩增检测系统)检测细胞内IL-4和TNF-α两种因子m RNA(Messenger RNA,信使核糖核酸)相对表达水平;应用WB(Western Blot,蛋白质印迹法),检测IgE/FcεRⅠ介导的信号通路关键上下游蛋白p-Lyn/Lyn、p-Syk/Syk及MAPK家族p-JNK/JNK、p-ERK/ERK、p-P38/P38蛋白表达。统计学方法,采用Graph Pad Prism5软件作图并分析数据,实验结果以均数±标准差(`x±s)表示。采用独立样本t检验(Independent Samples T test)进行两组间比较,采用单因素方差分析(One Way ANOVA)进行多组间比较,进一步采用SNK(Student-Newman-Keuls)法进行组间两两比较,P<0.05认为有统计学意义。形态学资料以图片表示并描述。研究结果:绘制出RBL-2H3细胞生长曲线,确定最佳接种密度为2×10~5/m L。RBL-2H3细胞脱颗粒模型建立条件为:125ng/m L DNP(2,4-dinitrophenylated)-IgE致敏细胞过夜,次日使用500ng/m L DNP-HSA(2,4-dinitrophenylated human serum albumin)进行激发,分别在DNP-HSA作用30分钟时检测细胞上清液中HIS水平,作用1小时检测β-HEX水平,作用4小时检测细胞炎性因子IL-4和TNF-α的释放水平。应用C48/80诱导RBL-2H3细胞脱颗粒模型确定C48/80的工作液浓度为10μg/m L,刺激时间为20分钟,并在倒置显微镜下记录细胞活化后的形态学改变,工作液浓度过高,刺激时间过长均对细胞形态造成破坏,出现细胞皱缩、漂浮。当BAI浓度为3.125-50.000μM作用时间为24小时,发现BAI对RBL-2H3细胞增殖活性无明显变化(P﹥0.05),但是当浓度大于50.000μM时,发现BAI可以诱导RBL-2H3细胞凋亡,其中浓度为100.000μM时凋亡率为7.62%(与对照组相比P﹤0.01),浓度为200.000μM时凋亡率为10.86%(与对照组相比P﹤0.001),由此可见,促凋亡作用呈剂量依赖性(各组间相比P﹤0.05)。细胞脱颗粒模型稳定建立后(IgE/FcεRⅠ途径),通过细胞形态学观察发现BAI在3.125-50.000μM的浓度下对RBL-2H3细胞活化脱颗粒具有一定的抑制作用;ELISA检测结果显示,细胞上清液中β-HEX、HIS、IL-4和TNF-α释放量与对照组相比显著降低,表明BAI对RBL-2H3细胞脱颗粒反应具有抑制作用(P﹤0.05),尤其以25.000和50.000μM抑制作用明显(P﹤0.001);50.000μM的BAI作用RBL-2H3细胞后,发现细胞内IL-4和TNF-α的m RNA相对水平较低,表明BAI对细胞炎症因子的生成表现出良好的抑制作用(P﹤0.001)。同时发现,BAI在12.500-50.000μM浓度下对C48/80诱发的RBL-2H3细胞脱颗粒同样有明显抑制作用(P﹤0.001)。进一步探索BAI抑制IgE/FcεRⅠ途径介导细胞活化脱颗粒的分子机制发现,在激发RBL-2H3细胞脱颗粒前使用BAI作用后,可以明显降低IgE/FcεRⅠ介导的信号通路关键蛋白Lyn、Syk、ERK、JNK、p38磷酸化水平,抑制细胞内颗粒物和炎性因子的产生和释放,显示出BAI抗Ⅰ型超敏反应的作用机制。研究结论:1.黄芩素能体外抑制IgE途径和C48/80途径诱导的RBL-2H3细胞活化脱颗粒反应,其作用机制可能与稳定细胞膜和抑制炎性因子生成有关。2.黄芩素抗Ⅰ型超敏反应的分子机制可能与降低IgE/FcεRⅠ介导的信号通路转导关键蛋白Lyn、Syk和MAPK家族磷酸化水平相关。