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鼠疫是由鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)引起的人畜共患烈性传染病。由于鼠疫的高致病性和能够通过气溶胶在人与人之间传播,所以鼠疫因为可以作为生物武器和生物恐怖手段而引起广泛的关注。所以有效的鼠疫疫苗的研究是必要的。目前,鼠疫疫苗的发展主要集中在荚膜抗原(F1)及低钙反应蛋白(LcrV)。最近许多研究表明,重组的LcrV、F1及F1-V亚单位疫苗对肺鼠疫有很好的保护效果。F1亚单位疫苗的局限性表现在它仅仅适合于F1阳性株,而LcrV亚单位疫苗容易引起免疫抑制作用。所以,其它抗原和LcrV/F1重组的亚单位疫苗能够对多种Y. pestis感染提供保护性,或者新的抗原能成为更有效的候选疫苗抗原,这些是鼠疫疫苗研究的方向和重点。理想的候选疫苗就是能够包括更多的独毒力因子,多个III分泌系统的结构蛋白和功能蛋白混合起来将能够满足理想候选苗的要求。因此本试验研究III分泌系统的孔道蛋白YscF的免疫保护性。在各种鼠疫疾病之中,尤以肺鼠疫破坏最大。为了达到长期有效地抗肺鼠疫的目的,加强鼠疫黏膜佐剂疫苗的研究是十分必要的。本研究从B群2b型脑膜炎奈瑟氏双球菌中提取蛋白体佐剂;基因重组了组成蛋白体的三个分子PorA,PorB和Class 4,为制备黏膜佐剂疫苗提供可靠的黏膜佐剂,进一步探讨滴鼻免疫Balb/c小鼠后诱导的免疫效果。通过比较筛选出黏膜佐剂蛋白体更有效的成分。1.从Y. pestis EV76株的质粒中钓取编码YscF抗原的基因片段,原核融合表达载体pET32a上,转入宿主菌E. coli BL21,用IPTG诱导表达重组融合蛋白rYscF,采用Ni2+亲和层析方法,对用工程化E. coli BL21(DE3)表达的重组Y. pestisYscF抗原进行纯化,目标蛋白纯度达到80%以上。以蛋白体作为佐剂吸附疫苗,分别经三针肌内注射免疫和滴鼻免疫Balb/c小鼠后,结果显示,以蛋白体为佐剂滴鼻免疫后能诱导较强的系统免疫和黏膜免疫。对鼻内Y. pestis的攻毒显示了有效的免疫保护力,存活率20%。所以,YscF是Y. pestis的一个很好的有免疫原性的抗原,重组Y. pestisYscF抗原有望作为改进的F1 + V亚单位疫苗的辅助成分。2.从B群2b型脑膜炎奈瑟氏双球菌中成功提取了高纯度的蛋白体,经检测蛋白体中内毒素含量、核酸含量和荚膜多糖的含量都低于样品的1%。Y. pestisYscF抗原与蛋白体佐剂分别以3∶1,在4℃疏水合成疫苗,滴鼻免疫小鼠。结果显示,蛋白体佐剂组和铝佐剂组比较,不仅提高了Y. pestisYscF抗原的系统免疫应答,而且能诱导小鼠呼吸道、消化道和生殖道等局部黏膜免疫应答,所以蛋白体将很有可能成为有效的黏膜免疫佐剂。3.PorA、PorB和Class 4类蛋白分子是蛋白体佐剂的主要成分,所以对它们佐剂作用的研究将会成为疫苗佐剂领域研究的新热点。将本室构建好的PorA/pET-28a(+)、PorB/pET-28a(+)和Class 4/pET-28a(+),在IPTG诱导下,在E. coli中诱导表达,获得了高纯度的重组蛋白,免疫印迹试验表明其具有良好的免疫原性。禽流感H5N1裂解疫苗与PorA、PorB和Class 4重组蛋白疏水混合成黏膜疫苗,滴鼻免疫小鼠。通过比较,抗原和佐剂剂量比例在3:1时免疫效果最佳。试验结果显示,PorA蛋白的免疫增强效果虽然没有蛋白体的好,但也能显著提高H5N1裂解病毒黏膜疫苗的系统免疫应答和黏膜免疫应答,而PorB和Class 4的免疫佐剂作用不显著。这在疫苗佐剂的研究中将是一个新的视点。