论文部分内容阅读
吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone,PQQ)是氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)中D-山梨醇脱氢酶与普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonicigenium vulgare)中L-山梨糖脱氢酶和L-山梨酮脱氢酶的辅酶。在前期构建G.oxydans WSH-003工程菌产2-酮基-L-古龙酸(2-keto-L-gulonic acid,2-KLG)的研究中发现,低效的辅酶PQQ的合成与再生过程是制约维生素C前体物质2-KLG产量进一步提升的关键因素。本论文以G.oxydans中PQQ合成途径为研究对象,建立了PQQ合成与再生过程研究所必需的PQQ高通量检测方法、G.oxydans电转化方法和适用于G.oxydans的无标记基因敲除体系的操作平台;在此基础上,系统研究了过量表达单个PQQ合成相关基因对G.oxydans重组菌PQQ产量和D-山梨醇脱氢酶活性的影响以及敲除tld D基因对G.oxydans重组菌生长速率和PQQ产量的影响。主要研究内容如下:(1)D-葡萄糖脱氢酶(PQQGDH)的表达与纯化和PQQ高通量检测方法的建立。在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中通过p ET-28a载体表达PQQGDH,进一步通过亲和层析提高了PQQGDH纯度。通过PQQGDH酶液和PQQ样品用量的双因素正交实验对传统重组酶法的反应体系加以改进,得到适用于96孔板高通量检测的反应体系。结果表明,30?L纯化后酶液、2?L PQQ样品配合1.2 m L的显色剂组成的显色体系检测效果最佳。利用纯化后酶液、96孔板和酶标仪建立的PQQ高通量检测方法在提高检测精度的同时,大幅提高了检测效率,为今后发酵液中PQQ的大规模检测打下了基础。(2)G.oxydans电转化方法和G.oxydans无标记基因敲除体系的建立。选取不同生长时期的G.oxydans细胞制作感受态,并考察不同电转化条件和转化后培养时间对G.oxydans电转化效率的影响。结果表明,在OD600为1.6-1.8时制作感受态,并在0.1 cm电转杯、1.8 k V电压、200Ω电阻、25?F电容条件下进行电转化,转化后培养2 h时转化效果最佳。构建了一株upp基因缺陷型G.oxydans,命名为G.oxydans WSH-003Δupp,改造常用于谷氨酸棒状杆菌无标记敲除体系中的敲除质粒p K19mobsac B,得到适用于G.oxydans的敲除质粒p K19mobupp。利用G.oxydans WSH-003Δupp和p K19mobupp可实现G.oxydans中基因的无标记敲除。(3)G.oxydans WSH-003中PQQ合成相关基因的过量表达和敲除。分别将6个PQQ合成相关基因与2个启动子组合,实现单个PQQ合成相关基因过表达。结果表明,除tld D基因外,过表达其他PQQ合成相关基因均一定程度提高了G.oxydans胞外PQQ产量。此外,过量表达PQQ合成相关基因后PQQ产量高的菌株中D-山梨醇到L-山梨糖的转化速率更高,且D-山梨醇脱氢酶酶活相应较高,证实了强化PQQ合成途径有利于相关发酵产品的生产。构建了一株tld D基因缺陷型G.oxydans WSH-003。结果表明,该突变株不能合成PQQ且细胞生长速率下降,证实tld D基因为该菌PQQ合成途径中必需的基因,且PQQ对G.oxydans细胞生长起明显促进作用。