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荔枝是原产我国的重要热带和亚热带果树,果实发育期间严重生理落果是影响产业发展的关键因素之一。目前,有关荔枝果实发育相关领域的分子机制研究主要集中在转录水平,鲜见小分子RNA水平,特别是与落果相关miRNA调控机制的研究。miRNA是一类长度约为20-22 nt的小分子RNA,除了能够在转录后水平对mRNA进行调控,还能诱发生成次级小RNA,即phasi RNA,进而参与到植物逆境胁迫和衰老等生命活动中。荔枝物种中这些miRNA存在什么样的调控机制?哪些miRNA参与了荔枝落果过程?为了解答上述疑问,本研究首先通过构建荔枝不同组织的小RNA文库、降解组文库和链特异性转录组文库,借助现有的荔枝基因组信息,鉴定了荔枝物种的miRNA和phasi RNA,解析它们在荔枝中调控网络,获得了miRNA耦合可变剪切/选择性多聚腺苷化产生不同phasi RNA的调控机制。其次,设计“环剥+去叶”处理营造碳水化合物胁迫诱导荔枝幼果脱落实验,获得了显著性生物和生理效果,筛选得到与落果过程显著相关的miRNA及其靶基因。本研究结果为荔枝物种的小RNA分子机制研究,特别是荔枝幼果脱落的转录后水平分子调控机制研究提供重要参考价值。主要研究结果如下:1.利用6个不同组织小RNA文库和4个降解组文库数据,全基因组水平上对荔枝miRNA及其靶基因进行了分析与鉴定,分别获得已知和新miRNA家族42个和40个,分别包含239个和51个成员。其中32个已知miRNA家族(214个成员)和13个新miRNA家族(20个成员)一共获得395个靶基因验证。经Nr数据库注释,靶基因主要为转录因子、抗病基因、植物激素信号传导及代谢路径有关基因和F-box家族蛋白。另外发现,除了保守的靶基因,已知mi NRA在荔枝中获得之前没有报道过的新靶基因,说明已知miRNA在进化中不仅能保持基本的功能,也能够获得一些新的靶基因从而获得新的功能。2.利用小RNA数据进行全基因组搜索,荔枝中一共获得515个PHAS位点,具有编码能力有420个,非编码位点有95个。具有编码能力的位点中,注释为R-gene最多,有180个,其次为Pentatricopeptide repeat-containing protein、反转录转座子gag蛋白(Retrotransposon gag protein)、激酶(Kinase)、赤霉素和生长素相关基因(Gibberellin receptor、生长素响应因子ARF、生长素受体TIR1)以及MYB转录因子,分别有51、35、25、19和17个。在非编码位点中,长度<200bp的最多,有49个,≧200bp的有46个,这些位点可能是lnc RNA。在进行phasi RNA的介导子miRNA鉴定时发现,52个PHAS位点获得了介导子miRNA的鉴定,包含了以下6条植物典型miRNA-phasi RNA途径:miR482/2118-NB-LRR、miR828-MYB、miR390-TAS3、miR393-TIR1/ARF、miR167-ARF和miR3954-NAC,以及1条荔枝特异miRNA-phasi RNA途径:miRN1-NB-LRR,但有463个PHAS位点没有获得介导子miRNA鉴定,说明phasi RNA的生成机制比原来理解的更为复杂。3.联合高通量数据、生物信息学和3’RACE技术,发现荔枝中miR482/2118家族功能呈现多样化,除了常规剪切降解或者翻译抑制功能以及介导抗病性基因或者非编码基因产生phasi RNA的功能外,还可以耦合可变剪切/选择性多聚腺苷化产生不同的phasi RNA,进而扩大了下游phasi RNA所调控靶基因的范围。这样的位点在荔枝中一共有29个,其中25个是与miR482/2118耦合,4个是与miR3954耦合。因此,提出了miRNA耦合可变剪切/选择性多聚腺苷化产生不同phasi RNA的调控机理模型。4.开展“环剥+去叶”处理营造碳水化合物胁迫诱导荔枝幼果脱落实验,结果显示碳水化合物胁迫显著促进了花后20d荔枝的幼果脱落。处理后落果率48h显著提升,至96h基本落完(此时落果率为95%,而对照只有8.2%)。对ETH、ABA和IAA的动态变化测定发现,碳水化合物胁迫增强了果柄离区和幼果中ETH的释放,增加了ABA含量,降低了IAA含量,引起I AA/ABA比值降低。幼果中上述3种内源激素差异大于果柄离区组织,说明碳水化合物胁迫处理诱导荔枝幼果脱落的重要生理原因之一就是通过改变幼果中内源IAA、ABA和乙烯含量及其之间的平衡来实现的。5.通过构建碳水化合物胁迫处理后0h、6h、12h、24h和48h的果柄离区和幼果处理和对照样品的一共36个s RNA文库,筛选到了40个miRNA家族(23个已知miRNA家族,包括77个家族成员;13个新miRNA家族,包括21个家族成员)的表达差异显著。差异表达miRNA调控网络分析发现,荔枝落果过程中主要miRNA的调控网络分别为:miR858-MYB、miR159-MYB、miR482/2118-R-gene、miR397-Laccase、miR160-ARF、miR393-TIR1、miR172-AP2、miR319-TCP、miR156-SPL、miR396-GRE、miR164-NAC、miRN1-R-gene、miR396-CP-RD21a、miR396-IAA14和miR396-Zn F等。说明碳水化合物胁迫荔枝落果过程中,参与荔枝落果的miRNA调控网络是十分庞大的。6.通过可视化评估法“ab initio”结合Kendallτ-consecutive和τ-trend统计方法,对碳水化合物胁迫荔枝落果过程中miRNA及靶基因表达模式进行相关性分析。结果发现在荔枝落果过程中,呈“Mix”(混合相关)的miRNA/靶基因对最多,单独符合“FN”(整个过程负相关)和“FP”(整个过程正相关)的miRNA/靶基因对只占一小部分,以及同一个miRNA对不同的靶基因以及同一个miRNA家族的不同成员对同一个靶基因的调控均具有不同的表达模式。说明碳水化合物胁迫诱导荔枝落果过程中miRNA对靶基因的调控是十分复杂的。7.采用qRT-PCR技术,对18条miRNA-靶基因调控通路进行表达分析,筛选和鉴定出10条可能参与了碳水化合物胁迫诱导荔枝落果的miRNA调控通路,分别为:miR160-ARF、miR393-TIR1、miR396-IAA14、miR397-Laccase和miR159-CKX1、miR156-SPL、miR482/2118-PGK、miR396-CP-RD21a、miR396-Zn F和miRN1-R-gene。