肝纤维化是由病毒感染、酒精、胆汁淤积、代谢性疾病及寄生虫感染等慢性致病因素引起的肝组织内细胞外基质（extracellular matrix,ECM）合成与降解不平衡,导致ECM过度沉积,进而引起的肝脏结构及功能异常,是各种慢性肝病发展为肝硬化,甚至肝癌的共同必经环节,严重威胁着人类健康。肝纤维化是一种可逆性病理变化。多种研究表明肝星状细胞、肝细胞、胆管上皮细胞、枯否细胞等肝内细胞均参与了肝纤维化的发生,其中,肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSCs）活化是肝纤维化发生发展的中心环节。生理情况下,HSCs处于静止状态,当肝脏受到损伤时,多种信号通路可刺激静止的HSCs发生活化。HSCs活化是肝纤维化发生的关键。活化的HSCs特异性表达α-SMA,并合成大量的ECM。同时其增殖、迁移及粘附能力增强,致使损伤局部大量HSCs聚集,合成并分泌ECM,且其降解减少,导致大量ECM沉积,形成增生性瘢痕。深入研究HSCs活化的发生机制是寻找抗纤维化治疗的有效靶点,阻止甚至逆转肝纤维化的关键。既往研究表明,TGF-β-SMAD3通路,PDGFRβ通路,HEDGEHO（Hh）通路等多种途径均可导致HSCs发生活化,但是目前临床上仍没有好的治疗靶点,我们仍需寻找其他促使HSCs发生活化的机制,以期找到潜在的有效治疗靶点。Piwi-interactingRNA（piRNA）是在哺乳动物生殖细胞中发现的一种新的调节RNA,是非编码RNA研究中的“明星”分子之一。它是一种长度在23-35个核苷酸的单链非编码RNA,因其仅与Argonaute蛋白家族中的PIWI亚蛋白家族结合而得名。最初研究表明,piRNA主要存在于哺乳动物的生殖细胞和干细胞中,通过与Piwi亚家族蛋白结合形成piRNA复合物（piRC）来调控基因沉默途径、维持生殖系和干细胞功能、调节翻译mRNA的稳定性等。近期多项研究发现piRNA也存在于生殖系细胞以外的正常体细胞（如心、脑、肝脏等组织的细胞）或癌细胞中,参与了胃癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤等多种癌症的发生发展,与中枢神经系统疾病、心脏再生等也密切相关。研究表明肝脏中表达丰富的piRNA。Rizzo F等应用小RNA高通量测序（smallRNA-Seq）研究发现,大鼠肝脏中可表达约1400种哺乳动物种系的piRNA,且参与调控肝脏细胞再生的病理生理过程;而人类肝脏中也含有丰富的pi RNA,且正常肝脏及肝硬化发展至肝癌过程中,piRNA表达特点不同。piR-823是piRNA家族中的一员。研究发现pi R-823可促进多发性骨髓瘤及结直肠癌中癌细胞的增殖;且其在肝硬化、肝癌前病变、肝癌中表达升高,HSCs的生物行为和癌细胞极为相似:活化的HSCs增殖能力增强且可分泌TGF-β1,而TGF-β1在肝癌患者中明显增多。因此,piR-823促进癌细胞增殖的作用可能也适用于HSCs。我们推测piR-823在肝纤维化时表达也增高,但目前尚没有piR-823在HSC中作用的研究。本课题旨在观察HSC活化过程中pi R-823的表达变化情况,阐明piR-823对HSC活化的调控作用及其可能的分子机制。本学位论文由以下三部分组成:第一部分piR-823在活化的肝星状细胞中的表达目的:研究肝纤维化小鼠的肝星状细胞中piR-823的表达变化及体外肝星状细胞活化过程中pi R-823的表达变化。方法:应用胆总管结扎及四氯化碳（carbon tetrachloride,CCL₄）腹腔注射法建立小鼠肝纤维化模型,应用原位灌流法分离培养正常及肝纤维化小鼠的肝星状细胞建立HSC体外活化模型。应用HE染色检测肝脏组织病理变化、马松染色和天狼猩红染色检测胶原沉积情况。赖氏法检测血清ALT、AST、TBIL的含量。免疫组织化学法（immunohistochemistry,IHC）、Western blot检测和real-time PCR方法检测COL1a1和α-SMA的蛋白及mRNA的表达。real-time PCR法检测piR-823表达差异。结果:1.小鼠肝纤维化模型建立成功采用CCl₄腹腔注射法诱导肝纤维化,实验分为4组:对照组（control）、CCL₄ 2 w组、CCL₄ 4 w组和CCL₄ 6 w组。对照组小鼠肝脏质地柔软,表面光滑,色泽鲜艳。CCL₄给药2 w组小鼠肝脏质韧,表面细颗粒样,随给药时间延长肝脏表面颗粒明显,呈黄褐色、体积稍缩小。H&E、马松及天狼星红染色结果显示,对照组小鼠肝板排列整齐,肝小叶结构完整,胶原纤维极少或缺如。2 w组小鼠有出血、坏死,肝细胞空泡、脂肪变性,炎细胞浸润,少量胶原沉积,肝板排列及小叶结构尚正常,至4 w及6 w,小鼠肝脏的肝板正常排列消失,小叶结构紊乱,胶原纤维组织明显增生沉积。免疫组织化学结果表明,α-SMA和COL1a1在4 w及6 w组小鼠肝组织中阳性细胞数明显增多、染色加深,显著高于对照组。Western blot结果显示,与对照组相比,2 w、4 w、6 w组小鼠的COL1a1和α-SMA蛋白表达依次升高。且CCL₄干预组小鼠的ALT、AST水平较对照组明显升高。以上结果表明CCL₄诱导的肝纤维化模型建立成功。采用胆总管结扎法诱导肝纤维化,实验分为2组:假手术组（sham operation,SH）和胆总管结扎组（bile duct ligation,BDL）。SH组小鼠肝脏质地柔软,表面光滑,胆囊大小正常。BDL组小鼠胆囊明显增大,肝脏质韧,表面细颗粒样。H&E、马松及天狼星红染色结果显示染色结果显示,SH组小鼠肝板排列整齐,肝小叶结构完整,胶原纤维极少,胆管正常。BDL组小鼠肝脏有出血、坏死,炎细胞浸润,胆管明显扩张、肝板正常排列消失,小叶结构紊乱,胶原纤维组织明显增生沉积。免疫组织化学结果表明,BDL组小鼠肝组织中α-SMA和COL1a1阳性细胞数明显增多、染色加深,显著高于SH组。Western blotting及real-time PCR结果显示,与SH组相比,BDL组小鼠COL1a1和α-SMA的mRNA及蛋白表达升高。且BDL组小鼠的ALT、AST、TBIL水平较SH组明显升高。以上结果表明胆汁淤积性肝纤维化模型建立成功。2.成功提取小鼠原代HSCs于小鼠肝门静脉穿刺插管,用链酶及Ⅳ型胶原酶进行肝脏原位灌注,后应用密度梯度离心法分离小鼠原代HSCs。于显微镜下观察,刚分离的HSCs未活化,呈圆形或椭圆形,体积较大,折光性较强。在波长328 nm的倒置荧光显微镜下观察,细胞可自发蓝绿色荧光。经光镜及荧光显微镜鉴定,所提细胞纯度约为80%,细胞得率约为1×10⁵¹.5×10⁵/小鼠。将细胞接种于塑料培养瓶,24 h后细胞全部贴壁。本实验分别取培养第1、4、7天的原代HSCs进行检测,此时段的细胞分别为静止状态,部分活化状态和活化状态,即为HSCs的体外活化模型。3.肝星状细胞活化过程中,piR-823表达增加由肝纤维化小鼠肝脏提取的HSCs中piR-823表达也较对照组明显升高;而体外培养过程中自发活化的HSCs中,piR-823表达随HSCs活化程度增强而增多。这些数据表明,活化的HSCs中,piR-823的表达是增多的。结论:肝星状细胞活化（体内和体外）过程中,piR-823表达增加。第二部分piR-823促进肝星状细胞活化及小鼠肝纤维化目的:研究升高和敲低piR-823表达对肝星状细胞活化的影响。方法:将人工合成的piR-823正义序列（piR-823 mimics）及反义序列（piR-823 antagomir）转染入LX-2和小鼠原代HSCs中,以建立piR-823低表达和高表达的肝星状细胞株。应用real-time PCR方法检测piR-823表达情况,real-time PCR和Western Blotting方法检测HSCs中α-SMA、COL1a1的mRNA水平及蛋白水平表达变化情况。应用CCK-8及BrdU方法检测LX-2及小鼠原代HSCs细胞的活性及增殖能力。用带有GFAP特异启动序列的AAV病毒,携带piR-823 antisense转染小鼠,以敲低其肝内HSCs中piR-823的表达。应用HE染色检测肝脏组织病理变化、马松染色和天狼猩红染色检测胶原沉积情况。赖氏法检测血清ALT、AST、TBIL的含量。免疫组织化学法（immunohistochemistry,IHC）、Western blotting检测和real-time PCR方法检测COL1a1和α-SMA的蛋白及mRNA的表达,明确小鼠肝纤维化情况。结果:1.成功在肝星状细胞中过表达及抑制piR-823将piR-823 mimics,pi R-823 antagomir转染入小鼠原代HSCs和LX-2中,增强或抑制了piR-823表达,成功在肝星状细胞中过表达及抑制piR-823。2.上调pi R-823表达可促进HSCs活化（1）Western Blotting检测及Real-time PCR检测结果显示,与对照组相比,转染piR-823 mimics的小鼠原代HSCs及LX-2细胞中α-SMA、COL1a1蛋白及mRNA表达均升高。（2）利用CCK-8法检测细胞活性,结果显示,在同一检测时间点内,转染piR-823 mimics的小鼠原代HSCs及LX-2细胞的细胞活力较转染mimics-NC的细胞明显增高。（3）Brdu法检测细胞增殖,结果显示,转染piR-823 mimics的小鼠原代HSCs的及LX-2细胞的Brdu掺入值明显高于转染mimics-NC的细胞。这些数据说明,上调piR-823表达促进HSCs的合成、分泌及增殖功能,提高HSCs的活性,促进HSCs活化。3.敲低pi R-823表达可抑制HSCs活化（1）Western Blotting检测及Real-time PCR检测结果显示,与对照组相比,转染piR-823 antagomir的小鼠原代HSCs及LX-2细胞中α-SMA、COL1a1蛋白及mRNA表达均降低。（2）利用CCK-8法检测细胞活性,结果显示,在同一检测时间点内,转染piR-823 antagomir的小鼠原代HSCs及LX-2细胞的细胞活力较对照组细胞明显降低。（3）Brdu法检测细胞增殖,结果显示,转染piR-823 mimics的小鼠原代HSCs的及LX-2细胞的Brdu掺入值明显低于对照组细胞。这些数据说明,敲低piR-823表达抑制HSCs的合成、分泌及增殖功能,减弱HSCs的活性,抑制HSCs活化。4.敲低小鼠体内原代HSCs中pi R-823表达可减弱其肝纤维化程度用AAV-pGFAP-piR-823 antisense敲低小鼠体内原代HSCs中piR-823表达后,与对照组相比,实验组小鼠肝脏炎症减轻,肝内沉积的胶原减少,肝内α-SMA、COL1a1表达量减少,血清ALT明显降低,肝纤维化减弱。结论:升高piR-823表达可促进HSCs活化,反之,抑制piR-823表达可抑制HSCs活化,减轻肝纤维化程度。第三部分piR-823通过上调TGF-β1表达促进肝星状细胞活化目的:探究piR-823促进肝星状细胞活化的分子机制。方法:应用RNA沉淀（pull down）技术及液质联质谱分析（liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS）寻找piR-823在HSCs中特异结合的蛋白。应用脂质体将siRNA转染入细胞改变目标蛋白的表达,观察其对HSCs的影响。结果:1.piR-823可与EIF3B特异结合应用RNA pull down技术联合质谱分析方法得到piR-823可特异结合的蛋白。对筛选出的EIF3B进一步验证,RNA pull down联合Western Blotting检测结果证实,pi R-823特异结合于EIF3B。RIP结果证实,以IgG为对照,EIF3B可与piR-823结合。这些数据表明,piR-823可与EIF3B特异结合。2.EIF3B调节TGF-β1蛋白翻译Real-time PCR及ELISA结果显示,敲低EIF3B后,TGF-β1蛋白水平表达减少,但mRNA表达不受影响。提示EIF3B可影响TGF-β1蛋白的翻译。3.piR-823可促进TGF-β1蛋白表达Real-time PCR及ELISA结果显示,上调piR-823表达后,TGF-β1蛋白表达增多但其mRNA表达不受影响。敲低piR-823表达,TGF-β1蛋白表达较对照组减少但mRNA表达无明显差异。这些数据表明,piR-82可调控TGF-β1蛋白表达。4.piR-823通过与EIF3B特异结合促进TGF-β1蛋白表达应用mimics-823及siEIF3B对LX-2细胞进行共转染,观察EIF3B对piR-823作用的影响。Real-time PCR结果显示,EIF3B及pi R-823均对TGF-β1 mRNA水平表达无影响。ELISA结果显示,敲低EIF3B可抑制piR-823上调TGF-β1蛋白表达的作用。实验结果表明,piR-823可通过结合EIF3B促进TGF-β1蛋白表达。结论:在HSCs中,piR-823可通过与EIF3B特异结合,上调TGF-β1蛋白表达,进而影响HSCs的活化。