细胞毒类抗肿瘤药物能杀伤肿瘤细胞,但这些药物对正常的细胞同样有较大杀伤力,从而极大的限制了该类药物的进一步应用和发展。单克隆抗体具有良好的靶向性,但是其对肿瘤细胞的杀伤力往往较弱甚至没有。抗体偶联药物(antibody-drug conjugates, ADCs),即毒性药物与单抗相连接组成化学免疫偶联物,将药物“精确”地运送到靶细胞,既有效地提高了肿瘤局部的药物浓度,又极大地降低了体内其他组织、器官的药物浓度,从而达到增效减毒的作用。1958年Mathe首次将抗鼠白细胞免疫球蛋白与甲氨蝶呤偶联用于靶向治疗,拉开了抗体偶联药物的研究序幕。但是几十年的研究里,没有一个抗体偶联药物的疗效和安全性达到足够要求成为治疗性的药物,直至2000年美国FDA批准Mylotarg上市,抗体偶联药物的研究与开发再次成为生物技术药物的新热点。多种抗体如anti-her2抗体Herceptin、BR96、anti-CD30、anti-CD33、anti-CD79等和多种毒性药物海兔毒素(MMAE)、阿霉素(DOX)、 Calicheamicin、美登素(Maytansine, AP3为其中一种)等被用来做抗体偶联药物的研究,包括对连接抗体的选择改造,连接方式的改进,连接药物的选择改造等。到目前,临床研究中的抗体偶联药物有20余种,2011年brentuximab vedotin上市,T-DM1也于2013年2月获FDA批准上市。CD20是一种在成熟B细胞表面高表达的蛋白,同时也在95%以上的B细胞性淋巴瘤细胞表面高表达,这个特性使之成为靶向单克隆治疗的重要靶点。事实上,抗CD20抗体已经被广泛用来治疗B细胞性淋巴瘤。抗体与CD20结合以后,通过引起细胞凋亡以及抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(Antibody Dependent Cell Mediated Cytotoxicity, ADCC)、补体依赖的细胞毒作用(complement dependentcytotoxicity, CDC)发挥杀伤作用。但是,抗CD20抗体常因温和的杀伤能力在治疗CD20阳性B细胞淋巴瘤上存在缺陷：只对部分病人有治疗效果,对一些CD20阳性病人起初就无效或者很快使其产生耐药；治愈率低；躲避抗体杀死的肿瘤细胞很快造成病情复发。因此,提高抗CD20抗体杀伤肿瘤靶细胞的能力成了临床研究中迫切需要解决的问题,而抗体偶联药物的理论似乎可以满足这一需求。的确有研究将MMAE或者Calicheamicin偶联抗CD20抗体Rituximab (RTX)使其活性得到了改善,但是,此方法是否也适用于其他众多的抗CD20抗体并未见报道。为了提高抗CD20抗体直接杀伤CD20阳性细胞的能力及确认方法的适应性,本文将选择多种抗CD20抗体,即Rituximab (RTX)、 Ofatumumab (OFA)和TGLA三种抗体进行研究。RTX是第一个上市用来治疗非霍奇金淋巴瘤(B-cell non-Hodgkin lymphoma, B-NHL)的抗CD20嵌合抗体；OFA是第一个上市用来治疗慢性淋巴细胞白血病(CLL)的全入源化抗CD20抗体；而TGLA是一种具有RTX同样靶点、近似活性的抗CD20单克隆抗体。本文首先选择了TGLA抗体和DOX、MMAE、AP3(一种美登素)三种药物进行偶联探索和活性观察；同时为了验证方法的适应性,我们将选择一种药物再和其他两种抗CD20抗体RTX、OFA进行偶联及活性研究。本研究不仅采用抗体赖氨酸的侧链胺基或二硫键还原的巯基形式结合药物,也选择了一种抗CD20抗体进行恒定区的半胱氨酸突变以定点定量的方式偶联毒性药物,使抗体能够在保持亲和性、CDC、ADCC活性的提前下提高直接杀伤肿瘤细胞的活性,从而为高效低毒的抗CD20抗体偶联药物临床开发提供理论和实验基础。一、抗肿瘤小分子的改造目前抗体偶联药物研究中所使用的小分子主要有海兔毒素(MMAE),美登素(Maytansine),刺包霉素(Calicheamicin),阿霉素(DOX)等。这些小分子往往不能直接和抗体偶联,需要借助连接物或者连接基团才能达到偶联的目的。本章我们选用具有代表性的毒性药物阿霉素(DOX)和Maytansine (AP3)进行连接前改造,为后续实验垫定物质基础。DOX所采用是抗体偶联药物临床研究中较常使用的连接物maleimidocaproyl-valine-citrulline-p-aminobenzylcarbonyl (MC-Val-Cit-PABC)。 MC能够和抗体被还原出的巯基反应,PABC部分可以连接药物分子的—OH或—NH2基团(若药物分子中无—OH或—NH2基团,则要进行相应改造),肽链在血液中较稳定,但当抗体偶联药物进入肿瘤细胞时便被溶酶体酶酶切释放出游离药物,发挥药效。本研究参考Gene M. Dubowchik等报道的合成路线,并通过改进合成条件缩短了反应时间,以Fmoc-Val-OSu、瓜氨酸(Cit)、对氨基苯甲醇(PABOH)、6.(马来酰亚胺基)已酸琥珀酰亚胺酯(MC)等为原料经过六步反应合成阿霉素的连接物MC-Val-Cit-PABC-DOX,各步产物采用核磁和质谱确定,终产物经过酶切鉴定能释放出药物DOX.AP3常以高毒性的DM1形式被用于抗体偶联药物的研究中。本研究参照专利里报道过的DM1合成路线,以AP3为起始原料,还原成AP0,然后再经过四步反应合成带有巯基的DM1,DM1可以和经过修饰后的抗体偶联。二、传统抗体偶联药物的合成及生物学活性研究为了建立传统以抗体赖氨酸的侧链胺基或二硫键还原的巯基结合药物的连接方式,并观测各种药物对抗CD20抗体杀伤活性的直接影响,我们选用新型的抗CD20抗体TGLA为载体进行了与MC-Val-Cit-PABC-DOX (vcDOX)、 MC-Val-Cit-PABC-MMAE (vcMMAE)和DM1的偶联实验。TGLA经过DTT还原出巯基以后,与vcDOX进行偶联。理论上总共可以结合8个药物,两条轻链各结合一个,两条重链各结合三个。经过条件摸索,实验中DOX/TGLA偶联数经紫外分光光度法检测最多能达到约6个。SDS-PAGE上显示轻链大部分已经结合上药物,而重链因为本身分子量大的原因在SDS-PAGE上没有分开。抗体偶联药物对靶细胞Raji细胞的杀伤能力相对Anti-CD20单抗略有提高。以vcDOX反应条件合成TGLA-vcMMAE,获得药物／抗体偶联比约6.4。TGLA和DM1的偶联采用可断开的二硫键SPDP形式及不可断开的硫醚SMCC形式。经过SPDP修饰,与DM1偶联的产物DM1/TGLA禺联数约在3.5,偶联物能够在二硫苏糖醇(DTT)作用下还原出游离药物DM1；以SPDP反应条件合成TGLA-SMCC-DM1,获得偶联比约2.9。对这些高毒性的抗体偶联药物进行细胞水平的活性比较,MMAE、DM1能够显著提高TGLA的活性。相比较DOX因为毒性较低只微弱的提高了TGLA的活性,提示我们选用高毒性药物作为偶联对象的重要性。三、不同抗CD20抗体的MMAE偶联物研究以往报道中对ADCs的研究通常是选定一种抗体进行多种药物或多种连接物的筛选,几乎没有文章讲述针对同一抗原的不同抗体偶联相同药物时是否也有区别。本章节中我们选用高毒性的vcMMAE作为连接药物,合成了三种抗CD20抗体OFA、RTX、TGLA的抗体偶联药物,并对这些偶联物的亲和性、吞噬、杀伤活性进行了评价。三种抗CD20抗体经过三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)还原再与MMAE偶联,5,5-二硫二硝基苯甲酸(DTNB)方法检测偶联数量约为7.5-7.6,流式细胞仪检测偶联后抗体结合细胞的能力有略微下降。流式和共聚焦结果显示抗体偶联药物都能够被CD20阳性肿瘤细胞WIL2-S吞噬,进一步对CD20抗原检测,发现CD20抗原也有相似程度的减少,说明偶联物是通过CD20抗原介导抗体偶联药物的吞噬。活性实验表明,抗CD20抗体偶联药物以后活性能够得到专一性的提高,只对CD20阳性细胞起作用。AN/PI双染和caspase, parp蛋白的WB显示偶联物通过诱导细胞凋亡来发挥杀死作用。我们的研究还表明,即使是对同一种细胞表面的抗原,不同的抗体作为载体制造偶联物时活性也是不同的。在细胞水平有较高活性的OFA偶联物在小鼠体内也表现出明显的抗肿瘤活性,所以选其作为突变偶联的抗体。四、2F2和突变体Thio-2F2的构建和表达采用传统的以抗体赖氨酸的侧链胺基或二硫键还原的巯基结合药物的连接方式带来不均一的产物,而且改变了抗体的结构降低了其亲和性。Jagath R Junutula等人在抗MUC16抗体的特定部位设计一个具有活性的半胱氨酸残基,能以确定的比例结合药物而不改变抗体对靶细胞的亲和性,并在体内外实验中证明了该抗体偶联药物的高效、低毒和长半衰期等种种优点。但是这个方法是否适合抗CD20抗体并未有过报道,因此,我们利用Jagath R Junutula报道的方法,对OFA(原名2F2)抗体进行类似改造,即在其特定部位设计一个具有活性的半胱氨酸残基,希望能以确定的比例结合药物提高杀伤能力而不改变抗体对靶细胞的亲和性、CDC、 ADCC等活性。将带有2F2DNA序列的表达载体导入到CHO细胞中稳定表达,获得了2F2。同时,对2F2进行突变,把重链恒定区第一位的丙氨酸A变成了半胱氨酸C,获得突变体Thio-2F2,并且初步证明突变体Thio-2F2保持了原抗体2F2的体外亲和性和CDC活性及体内抗肿瘤活性。五、Thio-2F2-vc的合成和生物学活性研究把Thio-2F2和vcMMAE进行定点定量的偶联,亲和性实验证实了2F2突变、偶联之后,亲和性、CDC、ADCC活性几乎没有受到影响,而抗体的体外杀伤CD20阳性细胞的能力得到了提高,对CD20阴性细胞不造成杀伤,说明了偶联物的良好靶向性。在Ramos淋巴瘤的裸鼠皮下移植瘤实验中,证明了其相对于原抗体和突变抗体抗肿瘤活性的提高。主要创新点：1.利用多种抗CD20抗体与多种毒性小分子偶联,获得了多种未经报道的新型高活性抗CD20抗体偶联药物,验证了抗CD20抗体偶联高毒性的药物能提高其杀伤CD20阳性肿瘤细胞的能力,初步搭建针对CD20靶点的抗体偶联药物技术平台。2.探索了多种anti-CD20-vcMMAE禺联物活性机理,阐明针对同一靶点的不同抗体偶联同样药物也具有活性差异,拓宽了抗体偶联药物的设计思路；其中所构建的全新抗体偶联药物OFA-vcMMAE在体内外实验中表现出极好的抗肿瘤活性,甚至在两种小鼠淋巴瘤模型中完全治愈肿瘤,且复发率极低。3.设计了2F2抗体的突变体,能够定点定量的偶联小分子药物,保证产物的均一性；更为重要的是该突变体与MMAE的偶联物能在保持原有抗体亲和性、CDC和ADCC活性的基础上提高其体内外抗肿瘤活性。该方法也为其他抗体或蛋白的偶联设计提供了参考。