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鸭甲肝病毒（Duck hepatitis A virus,DHAV）引起的鸭病毒性肝炎（Duck viral hepatitis,DVH）是危害养鸭业最为严重的传染病之一，主要病发于1～3周龄的雏鸭，可引起90％以上的死亡率，而35日龄以上的鸭感染DHAV后仅见一过性的精神沉郁。另外，临床感染DHAVs的病、死雏鸭尽管日龄不同，但同一脏器中病毒含量类似，这提示我们DHAV可以逃逸雏鸭尚未发育完善的免疫系统而增殖、致病。DHAV作为小RNA病毒科禽肝病毒属的唯一成员，包括三个基因型，分别对应于三个血清型DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3。目前对该病毒的研究已经从基因检测、克隆测序、进化树分析等过渡到了对其基因组功能和病毒与宿主之间相互作用的研究。 小RNA病毒3’UTR中存在的茎环结构、Poly(A)尾等二级结构可以通过与病毒其他部位、病毒蛋白或宿主细胞的蛋白相互作用来实现对病毒复制和翻译的调控，并以此影响病毒的感染力，目前尽管已对多种小RNA病毒3’UTR的结构与功能进行了研究，其调控病毒复制和翻译的分子机制也得到了部分阐明，但关于DHAV3’UTR结构与功能的研究在国际上仍属于空白区。基于此，本课题以本实验室前期制备的DHAV-1（LY0802株）和DHAV-3(SD1201株)DNA-Launched（DHAV-1L,DHAV-3L）传染性克隆为基础，研究了DHAV-1和DHAV-33’UTRs对病毒感染力的影响。另外本研究结合DHAV感染DEF后的RNA-seq分析，对DHAV感染的干扰素信号通路进行了研究，尝试从机体免疫、病毒与机体相互作用的层面入手，通过机体免疫功能的变化来解释鸭病毒性肝炎的致病机理。 （1）DHAV3’UTR对病毒感染力的研究 本研究从NCBI收录的DHAV毒株中随机选取5株DHAV-1、2株DHAV-2和5株DHAV-3分别进行Megalian分析，发现相同基因型的DHAV3’UTR具有相对保守的序列，而不同基因型DHAV的3’UTR序列中存在有共有基序α和β。使用RNAfold在线软件预测LY0802和SD11013’UTR的二级结构，除了poly(A)外，发现LY0802的3’UTR存在7个茎环结构，SD1101的3’UTR存在3个茎环结构，而保守序列α位于1L-C和3L-B茎环区，β位于1L-FG和3L-C茎环区。据此，本研究根据RNAfold预测结果构建了一系列的DHAV-1和DHAV-33’UTR缺失株。首先通过透射电镜验证了DNA-Launched的病毒装载有效性并发现DHAV-13’UTR全部缺失毒可以感染DEF并对宿主细胞造成轻微病变，这初步说明3’UTR对DHAV-1在细胞上的增殖是非必需的。接着本研究通过荧光定量PCR、间接免疫荧光和酶联免疫吸附试验从基因和蛋白水平上对DHAV3’UTR突变病毒在细胞中的增殖进行了进一步鉴定，结果证实了DHAV3’UTR对病毒的增殖有很大影响但并不是必需的。为了鉴定DHAV3’UTR的关键结构域，本研究通过分子病毒转染和感染两种模式，鉴定出了DHAV-13’UTR的关键结构域C和G、DHAV-33’UTR的关键结构域C，另外，结合DHAV感染DEF后的RNA-seq分析，1Δ1-314和1Δ1-339引起的宿主表达差异基因分别为415个（上调178，下调237）和4033个（上调1755，下调2278），我们证实虽然Poly(A)尾对DHAV-1病毒的复制不是必需的，但它的确可以影响DHAV的感染力。 （2）DHAV感染DEF后的转录组测序分析 DHAV-1L感染DEF细胞后对宿主细胞的mRNA做转录组学分析，发现差异表达基因5828个，其中上调基因为2025个，下调基因为3803个。所有差异基因被归类注释为67条GO term，涉及生物学过程（biological processes,BP）、细胞组分（cellular components,CC）及分子功能（molecular functions,MF）三大类。根据KEGG注释结果，差异表达基因富集在35条信号通路，其中信号转导通路最为富集，其次为内分泌系统通路和免疫系统通路。在与先天免疫相关的Toll样受体信号通路（Toll-like receptor signaling pathway）、RIG-I受体信号通路（RIG-I-like receptor signaling pathway）和NOD样受体信号通路（NOD-like receptor signaling pathway）三大模式识别受体信号通路中，DHAV感染组宿主的IκB、IL-6和IL-8在这三个通路中都有显著上调，另外在Toll样受体信号通路中，P13K、TRAF3和TBK1有显著下调，在RIG-I受体信号通路中，基因TRAF3、TBK1和MEKK1有显著下调，在NOD样受体信号通路中，Erbin有显著下调。IκB显著上调可以抑制NF-κB的解离入核，TRAF3和TBK1的显著下调抑制了IKKε/TBK1的活性从而阻止IRF3/7的转录活性。这两条通路共同抑制IFN-β的表达。据此我们推测DHAV-1L感染DEF后宿主干扰素基因或未得转录。 （3）DHAV-1感染DEF后的干扰素信号通路研究 本研究用等量DHAV-1L感染DEF后，分别于4h、8h、12h、16h、24h、36h和48h收集感染DHAV的DEF上清和细胞，对细胞总RNA进行干扰素β基因检测，结果发现DHAV-1L在DEF中的复制没有引起宿主细胞干扰素β基因的转录。然后又以聚肌胞转染感染DHAV-1的DEF细胞作为阳性对照，用酶联免疫法检测DEF细胞上清中干扰素蛋白的分泌，并用荧光定量 PCR检测干扰素诱导基因 PKR、OAS和 Mx的基因转录，结果发现DHAV的感染可以抑制宿主细胞内dsRNA对IFN-β的诱导作用且不同毒力的DHAV对 IFN-β的抑制能力也不同，另外DHAV的感染还可以抑制ISGs的转录。