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研究背景与目的：
围产期窒息往往导致新生儿缺氧缺血性脑损伤，这与新生儿高死亡率和严重的长期神经功能障碍密切相关，给患儿家庭和社会带来巨大的经济和精神负担。目前临床上缺乏有效的药物用于修复缺氧缺血造成的神经功能损伤。成纤维细胞生长因子21（FGF21）能通过简单扩散透过血脑屏障，对脑损伤具有潜在的神经保护作用。然而，FGF21对新生儿缺氧缺血性脑损伤的作用尚不清楚。本文将研究重组人FGF21（rhFGF21）在新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后是否能产生神经保护作用并深入探讨其保护机制，为新生儿缺氧缺血性脑损伤的治疗提供新的思路和方法。
方法：
1.新生大鼠缺氧缺血性脑损伤模型的建立和神经保护机制研究
生后7天的雄性SD大鼠，异氟烷麻醉后游离、结扎并离断左颈总动脉，回到母鼠身边恢复1-2小时，在氧气浓度为8%的缺氧箱中缺氧2.5小时，造模过程中电热毯维持温度在37℃。造模后24小时，激光散斑对比成像监测缺氧缺血后大鼠皮层脑血流变化。造模结束后，给药组分三组分别腹腔注射0.75mg/kg、1.5mg/kg和3mg/kgrhFGF21，连续给药3天，给药间隔24小时。造模后第3天，TTC染色法检测各组大鼠脑组织的缺血梗死情况，确定最佳给药剂量；造模后第7天，Tunel染色观察各组大鼠大脑皮层、海马CA3区神经元的凋亡情况。HE染色法观察各组大鼠脑萎缩程度、统计各组皮层和海马区域细胞个数；Nissl染色法观察神经元内尼氏体变化情况和计数神经元数目。造模后第21天，Rotarod实验和Morris水迷宫实验评估大鼠运动和学习记忆功能。连续监测造模后第0天、第7天、第14天、第21天大鼠的体重变化。蛋白质印迹法检测各组脑组织内p-FGFR1、FGFR1、β-klotho、p-Akt、Akt、MAP-2及凋亡相关蛋白bcl-2、cleavedcaspase3的表达情况。为进一步验证体内信号通路，侧脑室注射等体积DMSO、FGFR1抑制剂PD173074或PI3K抑制剂LY294002。
2.原代皮层神经元氧糖剥夺（OGD）模型的建立和神经元保护机制研究
体外培养原代皮层神经元8天，更换DMEM无糖培养基，不含胎牛血清（含1%双抗），将细胞转移至缺氧小室中（5%CO2，95%N2），37℃缺氧培养2小时，缺氧结束后更换正常的神经元培养基，立即给予5nM、10nM或50nMrhFGF21，常氧培养箱继续培养1小时或24小时。正常组细胞不换无糖培养基也不进行缺氧培养。OGD后1小时，蛋白质印迹法和免疫荧光染色检测原代皮层神经元内p-FGFR1、FGFR1、β-klotho、p-Akt和Akt等蛋白的表达情况。OGD后24小时，CCK-8法检测各组原代皮层神经元细胞活性变化；蛋白质印迹法检测bcl-2、cleavedcaspase3和MAP-2等蛋白的表达变化；Tunel染色观察原代皮层神经元OGD后的神经元凋亡情况。为进一步验证体外信号通路，联合使用rhFGF21和PD173074或LY294002。
结果：
1.生后7天的SD大鼠左颈总动脉结扎并缺氧后，左侧脑血流相对于右侧明显下降，证明新生大鼠缺氧缺血性脑损伤模型的成功建立。
2.1.5mg/kgrhFGF21腹腔给药显著减少新生大鼠脑梗死体积、减轻脑萎缩程度，增加各测量时间点大鼠体重。这些结果表明rhFGF21具有短期神经保护作用，能减轻脑梗死并改善大鼠整体健康水平。
3.蛋白质印迹法检测各组脑内相关蛋白的表达情况。结果显示HI后p-FGFR1/FGFR1和β-klotho表达无明显变化，但p-Akt/Akt表达下降；rhFGF21给药后p-FGFR1、β-klotho和p-Akt表达均增加，且能被PD173074抑制。此外，HI损伤后，脑内bcl-2、MAP-2表达下降，cleavedcaspase3表达升高；rhFGF21治疗后bcl-2和MAP-2表达表达升高，cleavedcaspase3表达降低。PD173074和LY294002均能逆转rhFGF21导致的凋亡相关蛋白和MAP-2的变化。
4.Tunel染色结果显示，rhFGF21可以减轻缺氧缺血导致的皮层和海马CA3区域神经元凋亡程度。
5.组织学染色和免疫组化结果显示rhFGF21给药后促进新生大鼠缺氧缺血后脑组织形态学恢复、稳定神经元微管功能。
6.神经行为学结果表明rhFGF21给药后促进新生大鼠缺氧缺血后运动和认知功能的恢复，rhFGF21的这些神经保护作用能被PD173074和LY294002部分抑制。
7.正常培养的神经元加入不同浓度rhFGF21（5nM、10nM和50nM）后培养24小时，CCK-8结果显示神经元活性无变化。OGD/复氧24小时后神经元活性下降至正常的66%。不同浓度rhFGF21处理细胞后，10nM和50nMrhFGF21在OGD/复氧24小时后均可增加神经经元活性。10nM的rhFGF21是作用细胞的最佳浓度。PD173074和LY294002可以抑制rhFGF21的作用，导致神经元活性下降。单独给两种抑制剂对细胞活性没有影响。
8.蛋白质印迹法结果显示给药1小时后，rhFGF21使p-FGFR1和β-klotho表达增加，并能被PD173074抑制；p-FGFR1和β-klotho免疫荧光共染结果与WB相似。OGD组p-Akt/Akt表达下降，给rhFGF21后p-Akt表达增加，且能被PD173074抑制，各组间Akt表达不变；OGD后复氧24小时，OGD组bcl-2、MAP-2表达下降，cleavedcaspase3表达升高。rhFGF21逆转了凋亡相关蛋白变化，并使MAP-2表达上升。rhFGF21引起的蛋白变化均能被PD173074和LY294002逆转。
9.Tunel染色结果显示，rhFGF21通过抑制OGD导致的原代皮层神经元凋亡保护神经元细胞，减少神经元细胞死亡。
结论：
FGF21对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤具有短期和长期的神经保护作用。通过体内和体外实验，我们证实外源性rhFGF21通过形成FGF21/FGFR1/β-klotho复合物，激活PI3K/Akt信号通路，促进缺氧缺血性损伤后神经元的存活和神经功能的恢复。因此，rhFGF21可能是治疗新生儿HIE的一种有效的药物。
围产期窒息往往导致新生儿缺氧缺血性脑损伤，这与新生儿高死亡率和严重的长期神经功能障碍密切相关，给患儿家庭和社会带来巨大的经济和精神负担。目前临床上缺乏有效的药物用于修复缺氧缺血造成的神经功能损伤。成纤维细胞生长因子21（FGF21）能通过简单扩散透过血脑屏障，对脑损伤具有潜在的神经保护作用。然而，FGF21对新生儿缺氧缺血性脑损伤的作用尚不清楚。本文将研究重组人FGF21（rhFGF21）在新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后是否能产生神经保护作用并深入探讨其保护机制，为新生儿缺氧缺血性脑损伤的治疗提供新的思路和方法。
方法：
1.新生大鼠缺氧缺血性脑损伤模型的建立和神经保护机制研究
生后7天的雄性SD大鼠，异氟烷麻醉后游离、结扎并离断左颈总动脉，回到母鼠身边恢复1-2小时，在氧气浓度为8%的缺氧箱中缺氧2.5小时，造模过程中电热毯维持温度在37℃。造模后24小时，激光散斑对比成像监测缺氧缺血后大鼠皮层脑血流变化。造模结束后，给药组分三组分别腹腔注射0.75mg/kg、1.5mg/kg和3mg/kgrhFGF21，连续给药3天，给药间隔24小时。造模后第3天，TTC染色法检测各组大鼠脑组织的缺血梗死情况，确定最佳给药剂量；造模后第7天，Tunel染色观察各组大鼠大脑皮层、海马CA3区神经元的凋亡情况。HE染色法观察各组大鼠脑萎缩程度、统计各组皮层和海马区域细胞个数；Nissl染色法观察神经元内尼氏体变化情况和计数神经元数目。造模后第21天，Rotarod实验和Morris水迷宫实验评估大鼠运动和学习记忆功能。连续监测造模后第0天、第7天、第14天、第21天大鼠的体重变化。蛋白质印迹法检测各组脑组织内p-FGFR1、FGFR1、β-klotho、p-Akt、Akt、MAP-2及凋亡相关蛋白bcl-2、cleavedcaspase3的表达情况。为进一步验证体内信号通路，侧脑室注射等体积DMSO、FGFR1抑制剂PD173074或PI3K抑制剂LY294002。
2.原代皮层神经元氧糖剥夺（OGD）模型的建立和神经元保护机制研究
体外培养原代皮层神经元8天，更换DMEM无糖培养基，不含胎牛血清（含1%双抗），将细胞转移至缺氧小室中（5%CO2，95%N2），37℃缺氧培养2小时，缺氧结束后更换正常的神经元培养基，立即给予5nM、10nM或50nMrhFGF21，常氧培养箱继续培养1小时或24小时。正常组细胞不换无糖培养基也不进行缺氧培养。OGD后1小时，蛋白质印迹法和免疫荧光染色检测原代皮层神经元内p-FGFR1、FGFR1、β-klotho、p-Akt和Akt等蛋白的表达情况。OGD后24小时，CCK-8法检测各组原代皮层神经元细胞活性变化；蛋白质印迹法检测bcl-2、cleavedcaspase3和MAP-2等蛋白的表达变化；Tunel染色观察原代皮层神经元OGD后的神经元凋亡情况。为进一步验证体外信号通路，联合使用rhFGF21和PD173074或LY294002。
结果：
1.生后7天的SD大鼠左颈总动脉结扎并缺氧后，左侧脑血流相对于右侧明显下降，证明新生大鼠缺氧缺血性脑损伤模型的成功建立。
2.1.5mg/kgrhFGF21腹腔给药显著减少新生大鼠脑梗死体积、减轻脑萎缩程度，增加各测量时间点大鼠体重。这些结果表明rhFGF21具有短期神经保护作用，能减轻脑梗死并改善大鼠整体健康水平。
3.蛋白质印迹法检测各组脑内相关蛋白的表达情况。结果显示HI后p-FGFR1/FGFR1和β-klotho表达无明显变化，但p-Akt/Akt表达下降；rhFGF21给药后p-FGFR1、β-klotho和p-Akt表达均增加，且能被PD173074抑制。此外，HI损伤后，脑内bcl-2、MAP-2表达下降，cleavedcaspase3表达升高；rhFGF21治疗后bcl-2和MAP-2表达表达升高，cleavedcaspase3表达降低。PD173074和LY294002均能逆转rhFGF21导致的凋亡相关蛋白和MAP-2的变化。
4.Tunel染色结果显示，rhFGF21可以减轻缺氧缺血导致的皮层和海马CA3区域神经元凋亡程度。
5.组织学染色和免疫组化结果显示rhFGF21给药后促进新生大鼠缺氧缺血后脑组织形态学恢复、稳定神经元微管功能。
6.神经行为学结果表明rhFGF21给药后促进新生大鼠缺氧缺血后运动和认知功能的恢复，rhFGF21的这些神经保护作用能被PD173074和LY294002部分抑制。
7.正常培养的神经元加入不同浓度rhFGF21（5nM、10nM和50nM）后培养24小时，CCK-8结果显示神经元活性无变化。OGD/复氧24小时后神经元活性下降至正常的66%。不同浓度rhFGF21处理细胞后，10nM和50nMrhFGF21在OGD/复氧24小时后均可增加神经经元活性。10nM的rhFGF21是作用细胞的最佳浓度。PD173074和LY294002可以抑制rhFGF21的作用，导致神经元活性下降。单独给两种抑制剂对细胞活性没有影响。
8.蛋白质印迹法结果显示给药1小时后，rhFGF21使p-FGFR1和β-klotho表达增加，并能被PD173074抑制；p-FGFR1和β-klotho免疫荧光共染结果与WB相似。OGD组p-Akt/Akt表达下降，给rhFGF21后p-Akt表达增加，且能被PD173074抑制，各组间Akt表达不变；OGD后复氧24小时，OGD组bcl-2、MAP-2表达下降，cleavedcaspase3表达升高。rhFGF21逆转了凋亡相关蛋白变化，并使MAP-2表达上升。rhFGF21引起的蛋白变化均能被PD173074和LY294002逆转。
9.Tunel染色结果显示，rhFGF21通过抑制OGD导致的原代皮层神经元凋亡保护神经元细胞，减少神经元细胞死亡。
结论：
FGF21对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤具有短期和长期的神经保护作用。通过体内和体外实验，我们证实外源性rhFGF21通过形成FGF21/FGFR1/β-klotho复合物，激活PI3K/Akt信号通路，促进缺氧缺血性损伤后神经元的存活和神经功能的恢复。因此，rhFGF21可能是治疗新生儿HIE的一种有效的药物。