论文部分内容阅读
背景：
心血管疾病仍然是世界范围内人类发病和死亡的最常见原因。心肌梗死、高血压、心肌病、血流动力学负荷过重、炎症等心血管疾病最终都会导致心力衰竭。长期病理条件下引发心肌细胞的肥大和凋亡，血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的功能障碍以及成纤维细胞的分化和增殖。心脏重构是心脏衰竭的关键环节，心脏在肥大初期具有代偿功能，但后期由于心肌细胞损伤、心脏纤维化等因素使心脏结构和功能发生改变，进而导致心脏重构和功能障碍。
长链非编码RNA（LncRNA）可通过表观遗传调控、剂量补偿效应、细胞周期调控和细胞分化调控等方式在细胞生长分化、胚胎发育和疾病的发生发展中发挥重要作用。最近的研究表明，LncRNA在心脏发育中起一系列重要作用。然而，LncRNA如何调控心力衰竭还不明确。因此，揭示LncRNA在心衰中的新机制，可为治疗心力衰竭提供新的研究方向和潜在靶点。
目的：
主动脉弓缩窄（TAC）术构建小鼠心脏压力超负荷模型，通过SE-LncRNAs芯片分析TAC术后小鼠心脏组织差异SE-LncRNAs和mRNAs的表达，使用严格的选择标准，确定与心脏重构相关的SE-LncRNAs。通过体内与体外实验探讨SE-LncRNA在小鼠心脏重构中的作用及可能涉及的信号通路，为治疗心力衰竭提供新的研究方向和潜在靶点。
方法：
1.构建小鼠TAC模型，检测小鼠心功能，称量心重体重比（HW/BW）、肺重体重比（LW/BW）、HE染色与WGA染色。提取各例左心室组织总RNA。
2.通过SE-LncRNAs芯片，检测TAC组与Sham组心脏组织SE-LncRNAs和mRNA的表达谱，筛选条件为：差异倍数大于或等于2、错误发现率小于或等于0.05和P值小于或等于0.05，进而获得TAC组与Sham组中差异表达的SE-LncRNAs和mRNAs。
3.选取差异最显著的一条SE-LncRNA命名为Cardiac remodeling related gene（CRRG）进行研究。提取小鼠乳鼠原代心肌细胞与心脏成纤维细胞，用AngⅡ刺激，qRT-PCR检测CRRG、ANP、BNP、α-SMA与collangeⅠmRNA的变化。随后进行细胞核质分离实验并qRT-PCR检测CRRG、GAPDH和U6的表达情况，同时进行与FISH探针实验。
4.体外实验：通过Ad-CRRG感染心脏成纤维细胞实现CRRG高表达，将细胞分为4组：Ad-Con组，Ad-CRRG组，Ad-Con+AngⅡ组和Ad-CRRG+AngⅡ组。进行细胞划痕和transwell小室实验，qRT-PCR检测α-SMA、collangeⅠ、fibronectin与MGP。体内实验：左心室壁注射Ad-CRRG使小鼠心脏中特异性高表达CRRG，经过TAC术后分为4组：Sham+Ad-Con组、Sham+Ad-CRRG组、TAC+Ad-Con与TAC+Ad-CRRG组。超声检测小鼠心功能，称量并计算HW/BW和LW/BW。HE染色、WGA染色检测心脏的形态与心肌横截面积，Masson染色检测心脏的胶原沉积情况，PCR与WB检测心脏肥大与纤维化指标。
5.通过Ad-sh-MGP感染心脏成纤维细胞实现MGP的沉默，进行细胞划痕和transwell小室实验，同时qRT-PCR检测各组的纤维化指标。
结果：
SE-LncRNAs芯片分析结果显示，TAC组和Sham组中差异表达的SE-LncRNAs共有24条，其中在TAC组发生上调的有18条，下调的有6条。其中与SE-LncRNA高度相关mRNA有8条有变化。扩大样本进行qRT-PCR验证差异表达的LncRNAs，大部分趋势与芯片结果一致，有8条LncRNAs具有显著差异。CRRG与心脏重构相关，其主要分布在心脏成纤维细胞的细胞核中。高表达CRRG可抑制AngⅡ刺激下心脏成纤维细胞向心脏肌成纤维转化，抑制心脏成纤维细胞迁移，下调纤维化基因产生。小鼠心脏中特异性高表达CRRG可改善TAC导致的心脏重构，改善小鼠心功能，减少心肌肥大与纤维化。GRRG促进MGP的表达，沉默MGP后GRRG抑制心脏成纤维细胞向心脏肌成纤维转化能力减弱，心脏成纤维细胞迁移能力增强。
结论：
SE-LncRNAs参与心脏重构的进程。CRRG主要分布于心脏成纤维细胞中。高表达CRRG后，改善TAC小鼠心功能，减少心肌肥大与纤维化，抑制心脏成纤维细胞向心脏肌成纤维转化，其作用可能依靠于其下游蛋白MGP。CRRG在心脏重构及过程发挥重要作用，高表达CRRG可以改善小鼠心脏重塑。
心血管疾病仍然是世界范围内人类发病和死亡的最常见原因。心肌梗死、高血压、心肌病、血流动力学负荷过重、炎症等心血管疾病最终都会导致心力衰竭。长期病理条件下引发心肌细胞的肥大和凋亡，血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的功能障碍以及成纤维细胞的分化和增殖。心脏重构是心脏衰竭的关键环节，心脏在肥大初期具有代偿功能，但后期由于心肌细胞损伤、心脏纤维化等因素使心脏结构和功能发生改变，进而导致心脏重构和功能障碍。
长链非编码RNA（LncRNA）可通过表观遗传调控、剂量补偿效应、细胞周期调控和细胞分化调控等方式在细胞生长分化、胚胎发育和疾病的发生发展中发挥重要作用。最近的研究表明，LncRNA在心脏发育中起一系列重要作用。然而，LncRNA如何调控心力衰竭还不明确。因此，揭示LncRNA在心衰中的新机制，可为治疗心力衰竭提供新的研究方向和潜在靶点。
目的：
主动脉弓缩窄（TAC）术构建小鼠心脏压力超负荷模型，通过SE-LncRNAs芯片分析TAC术后小鼠心脏组织差异SE-LncRNAs和mRNAs的表达，使用严格的选择标准，确定与心脏重构相关的SE-LncRNAs。通过体内与体外实验探讨SE-LncRNA在小鼠心脏重构中的作用及可能涉及的信号通路，为治疗心力衰竭提供新的研究方向和潜在靶点。
方法：
1.构建小鼠TAC模型，检测小鼠心功能，称量心重体重比（HW/BW）、肺重体重比（LW/BW）、HE染色与WGA染色。提取各例左心室组织总RNA。
2.通过SE-LncRNAs芯片，检测TAC组与Sham组心脏组织SE-LncRNAs和mRNA的表达谱，筛选条件为：差异倍数大于或等于2、错误发现率小于或等于0.05和P值小于或等于0.05，进而获得TAC组与Sham组中差异表达的SE-LncRNAs和mRNAs。
3.选取差异最显著的一条SE-LncRNA命名为Cardiac remodeling related gene（CRRG）进行研究。提取小鼠乳鼠原代心肌细胞与心脏成纤维细胞，用AngⅡ刺激，qRT-PCR检测CRRG、ANP、BNP、α-SMA与collangeⅠmRNA的变化。随后进行细胞核质分离实验并qRT-PCR检测CRRG、GAPDH和U6的表达情况，同时进行与FISH探针实验。
4.体外实验：通过Ad-CRRG感染心脏成纤维细胞实现CRRG高表达，将细胞分为4组：Ad-Con组，Ad-CRRG组，Ad-Con+AngⅡ组和Ad-CRRG+AngⅡ组。进行细胞划痕和transwell小室实验，qRT-PCR检测α-SMA、collangeⅠ、fibronectin与MGP。体内实验：左心室壁注射Ad-CRRG使小鼠心脏中特异性高表达CRRG，经过TAC术后分为4组：Sham+Ad-Con组、Sham+Ad-CRRG组、TAC+Ad-Con与TAC+Ad-CRRG组。超声检测小鼠心功能，称量并计算HW/BW和LW/BW。HE染色、WGA染色检测心脏的形态与心肌横截面积，Masson染色检测心脏的胶原沉积情况，PCR与WB检测心脏肥大与纤维化指标。
5.通过Ad-sh-MGP感染心脏成纤维细胞实现MGP的沉默，进行细胞划痕和transwell小室实验，同时qRT-PCR检测各组的纤维化指标。
结果：
SE-LncRNAs芯片分析结果显示，TAC组和Sham组中差异表达的SE-LncRNAs共有24条，其中在TAC组发生上调的有18条，下调的有6条。其中与SE-LncRNA高度相关mRNA有8条有变化。扩大样本进行qRT-PCR验证差异表达的LncRNAs，大部分趋势与芯片结果一致，有8条LncRNAs具有显著差异。CRRG与心脏重构相关，其主要分布在心脏成纤维细胞的细胞核中。高表达CRRG可抑制AngⅡ刺激下心脏成纤维细胞向心脏肌成纤维转化，抑制心脏成纤维细胞迁移，下调纤维化基因产生。小鼠心脏中特异性高表达CRRG可改善TAC导致的心脏重构，改善小鼠心功能，减少心肌肥大与纤维化。GRRG促进MGP的表达，沉默MGP后GRRG抑制心脏成纤维细胞向心脏肌成纤维转化能力减弱，心脏成纤维细胞迁移能力增强。
结论：
SE-LncRNAs参与心脏重构的进程。CRRG主要分布于心脏成纤维细胞中。高表达CRRG后，改善TAC小鼠心功能，减少心肌肥大与纤维化，抑制心脏成纤维细胞向心脏肌成纤维转化，其作用可能依靠于其下游蛋白MGP。CRRG在心脏重构及过程发挥重要作用，高表达CRRG可以改善小鼠心脏重塑。