新型食品保鲜剂的开发一直是食品工业研究的重要内容,保鲜剂可分为化学合成类和天然类,化学保鲜剂因其在食品中的残留可能具有潜在的毒副作用而引起消费者的担心,因此,寻找安全、有效且无毒副作用的天然保鲜剂是食品保鲜防腐领域的研究趋势。生物保鲜技术因其具有处理费用低、贮藏条件易控制和符合绿色环保要求的优点,成为食品保鲜领域研究的热点,该技术能够利用自然或人工控制的微生物菌群和（或）它们产生的抗菌物质来延长食品的货架期和提高食品安全性。微生物次级代谢产物一直是挖掘新型活性天然产物的宝贵资源库,特别是新型抗菌物质的巨大来源。非核糖体多肽类化合物是迄今微生物代谢产物中较大的家族之一,它是由非核糖体多肽合成酶（Non-ribosomal polypeptide synthetase,NRPS）合成。研究表明,该类化合物大多具有显著的抗菌活性,可作为发现新型食品保鲜剂的主要来源之一。传统的微生物代谢产物研究方法是基于可培养微生物,这种方法受实验室培养条件等多种因素影响,而且可培养微生物仅占微生物总量的1%,这极大限制了新型活性次级代谢产物的发现。近年来,随着分子生物学及测序技术的发展,出现了对不可培养微生物研究的宏基因组学技术,该技术绕开传统微生物的纯培养过程,直接提取环境DNA,在异源宿主中进行克隆表达,获得目的产物,实现对不可培养微生物的研究,为新型活性天然产物的挖掘提供了新资源、新方法和新途径。本研究利用宏基因组学技术,以NRPS编码基因中高度保守的腺苷酰化（adenylation,A）结构域序列为靶点,采用基于序列的定向筛选方法,获得含编码NRPS的目标基因序列,实现对土壤微生物代谢产物的靶向挖掘。（1）土壤宏基因组文库的构建与NRPS基因的筛选。以土壤为宏基因组建库研究对象,过筛除杂后,采用十六烷基三甲基溴化铵裂解法,直接提取土壤中的DNA,纯化后经琼脂糖凝胶电泳检测,采用噬菌体封装侵染的方法,构建了两个土壤环境DNA文库。以NRPS基因序列为靶点,采用简并引物进行筛选测序,经系统发育分析,得到51个含有A结构域的ORFs,依据这些序列设计特异性引物,采用96孔板梯度稀释法,回收得到含有特异性序列的9个单克隆,分别编码为DL8-1、DL5-12、DL15-1、DL23-3、DL5-6、DL10-2、DL9-3、BD5-1及BD3-2。对单克隆进行双末端测序分析,设计特异性引物,二次筛选,未筛选到与上述9个单克隆末端重叠的克隆子,需要对这些单克隆进行进一步分析。（2）NRPS基因序列的异源表达与产物预测。以大肠杆菌（Escherichia coli BL21（DE3））为宿主,对筛选到的目的基因进行异源表达。将上述9个单克隆中包含的目的基因序列,分别电转导入E.coli BL21（DE3）中,其中7个克隆子成功转化,小发酵离心萃取后旋转蒸发得到发酵粗提物,经高效液相色谱（HPLC）分析发现DL文库中的克隆子（DL8-1、DL5-12、DL15-1、DL23-3和DL5-6）表达产物中没有目标产物,而BD文库中的克隆子（BD5-1及BD3-2）表达产物中均有目标产物;选择BD5-1克隆子进行高通量测序,利用生物信息学在线软件antiSMASH进行分析,预测其含有完整的非核糖体多肽生物合成基因簇,提示BD5-1具有合成NRPS环肽化合物的潜力。（3）E.coli BL21（DE3）/BD5-1 表达产物的分离与鉴定。将E.coli BL21（DE3）/BD5-1大发酵后,利用有机试剂萃取和多种柱层析手段从发酵产物中分离得到10个单体化合物,利用现代波谱学技术和化学手段分别鉴定为环六肽（1）、环六肽（2）、双（吲哚-3-基）硫醚（3）、（脯氨酸-缬氨酸）环二肽（4）、（脯氨酸-酪氨酸）环二肽（5）、（脯氨酸-丝氨酸）环二肽（6）、化合物（7）、3,3-二-（3-吲哚）丙烷-1,2-二醇（8）、亚油酸甘油酯（9）、化合物（10）,其中环六肽1和环六肽2为新型NRPS环六肽。（4）单体化合物的抑菌活性评价。抑菌实验结果表明,化合物1对四联球菌（Micrococcus tetragenus）具有较强的抑制作用,MIC值小于2μM,对金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）和枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）也有很好的抑菌作用。特别是对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant aureus,MRSA）S.aureus AR1和S.aureus ZAyT2有良好的抑制作用,而阳性对照氨苄青霉素对这两种MRSA无抗性,提示环六肽1具有强的广谱抑菌活性。其他化合物无明显抑菌作用。该研究结果表明,利用宏基因组技术,以NRPS基因序列为靶点,能够从不可培养微生物的代谢产物中挖掘得到结构新颖、活性显著的环肽类化合物,为寻找新型抑菌化合物提供了新的研究策略,拓展了微生物次级代谢产物研究的方法和范围。