背景及目的急性胰腺炎（acute pancreatitis,AP）是一种常见的外科急腹症,由于缺乏特异性的治疗药物及方法,AP的临床治疗在当今生物医学高速发展的大背景下,仍是各位同道所共同面临的一大难题。AP致病的潜在机制尚未完全阐明,长久以来,AP发病早期的两项特征性改变,即腺泡细胞内大量空泡的堆积及胰酶的提前激活,一直是AP研究的热点。近年来,多项报道提示AP发病早期腺泡细胞内的空泡是自噬源性的,而胰酶的提前激活也被认为是缺陷性自噬的产物。硫化氢（hydrogen sulfide,H2S）是第三代内源性产生的气体信号分子。目前的资料支持H2S作为一种促炎因素在AP的发生、发展中起到一定程度的危害性作用,而介导H2S在AP发生、发展中促炎作用的潜在机制目前尚未明了。先前,我科研团队实验结果表明,抑制H2S的合成可通过增强细胞凋亡而减轻大鼠AP模型中的坏死性损伤。作为H2S相关的序贯性研究,本次研究的重点将是H2S在AP中对腺泡细胞缺陷性自噬的影响及其潜在机制。方法体内实验部分:将120只雄性Wistar大鼠随机分为四组,每组30只。AP组,胆胰管逆行注射3.5%的牛磺胆酸钠溶液（0.15 m L/100g）造模;sham组,仅行上腹部正中切开及肠管翻动;硫氢化钠（Na HS）组,AP造模1 h后经腹腔注射Na HS溶液1 m L（28μmol/kg）;DL-炔丙基甘氨酸（DL-propargylglycine,PAG）组,AP造模1 h后经腹腔注射PAG溶液1 m L（80 mg/kg）。所有各组生存的大鼠于AP造模3 h、6 h和12 h后随机处死,留取胰腺组织及血浆,妥善处理、保存。体外实验部分:将AR42J细胞或m GFP-RFP-微管相关蛋白轻链3（microtubule-associated protein light chain 3,LC3）标记的AR42J细胞分为四组。AP组,以500μmol/L的牛磺胆酸钠刺激AR42J细胞模拟AP;control组,对AR42J细胞给予等同于AP组牛磺胆酸钠使用剂量的磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline,PBS）;Na HS组,于AP诱导前30 min给予100μmol/LNa HS;PAG组,于AP诱导前60 min给予3 mmol/LPAG。特定实验中,10μmol/L氯喹（chloroquine,CQ）的2 h预处理或20μmol/LCompound C（CC）的1 h预处理将用作对各组细胞自噬水平的人工干预。所有各组细胞于AP模拟建立1 h、3 h和6 h后提取蛋白或40 min后进行胰酶激活分析。结果大鼠AP造模后6 h,胰腺组织病理学评分、炎症因子浓度、自噬性空泡堆积程度、LC3转化率及血浆淀粉酶、脂肪酶浓度均显著高于sham组;AP造模后以上指标的变化,可由Na HS的干预而进一步增强,也可由PAG的干预而明显减弱。AR42J细胞在AP诱导40 min后,胰酶激活明显增强;与AP组相比,Na HS组胰酶激活明显增强,PAG组胰酶激活明显减弱。大鼠胰腺组织溶酶体相关性膜蛋白-2（lysosome-associated membrane protein-2,LAMP-2）与LC3的免疫共位实验及m GFP-RFP-LC3标记的AR42J细胞内自噬流分析结果提示AP时,自噬体-溶酶体融合无障碍。在体外实验中,CQ的引入进一步明确了AP时自噬上游生成阶段的过度激活,且其程度与局部H2S的浓度成正相关。各组AR42J细胞蛋白中,AKT、腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine 5’-monophosphate activated protein kinase,AMPK）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,m TOR）的磷酸化水平检测结果显示:AP时,AMPK磷酸化水平上调而m TOR磷酸化水平下调,其程度与局部H2S浓度呈正相关。最后,CC的引入不仅可抑制AMPK活性,而且连m TOR下游ULK1及P70S6K的活性也一并抑制。结论H2S可通过AMPK/m TOR通路过度激活自噬从而加重AP相关性损伤。早期、主动的抑制内源性H2S产生及降低体内H2S浓度有望成为今后治疗AP的一个新途径。