大豆疫霉(Phytophthora sojae)引起的大豆疫霉根腐病是大豆生产上的毁灭性病害,每年在全世界范围内造成10-20亿美元的损失。大豆疫霉分泌大量效应分子进入植物细胞干扰植物免疫反应并促进侵染。这些效应分子中有一类蛋白在分泌信号肽后含有保守的Arg-X-Lys-Arg (RXLR)序列特征,被称为RXLR效应蛋白。大豆疫霉菌基因组中存在着300多个编码该类效应蛋白的基因,其中9个RXLR基因,如Avr1b、Avr3a、Avr4/6已被证明是大豆疫霉菌的无毒基因,这些基因的编码产物能被大豆进化出的抗病蛋白特异性地识别从而诱导大豆的抗病反应。然而,这些RXLR基因的生物学功能及其作用机理尚不清楚。针对该科学问题,本论文以实验室先前克隆到的无毒基因Avr3b为研究对象,开展了一系列遗传和生化实验,实验结果发现Avr3b能够通过其具有的NADH和ADP-ribose焦磷酸化酶的活性抑制植物的免疫反应,另外Avr3b还需要招募植物的cyclophilin蛋白激活它的毒性和无毒功能,初步揭示了 Avr3b的生物学功能和作用机理。大豆疫霉无毒效应分子Avr3b是调节植物免疫反应的NADH和ADP-ribose焦磷酸化酶。本研究发现在烟草中瞬时表达Avr3b基因能够增强烟草对辣椒疫霉和寄生疫霉的感病性,并且显著减少活性氧在侵染点的积累。Avr3b编码蛋白被预测含有具有转运到寄主胞内功能的RXLR motif、具有形成稳定蛋白结构的Wmotif和C端的水解酶功能域Nudix motif。通过生化实验本研究证实Avr3b具有NADH和ADP-ribose焦磷酸化酶活性,缺失Avr3b的Nudix motif或者突变该motif中决定水解酶活的关键氨基酸位点会导致Avr3b的酶活丧失,进而导致毒性功能减弱。另外,Avr3b也能够抑制大豆疫霉效应分子Avrlb引起的ETI反应。由于具有类似酶活的植物Nudix水解酶是植物免疫系统的负调节因子,因此,本研究结果提示病原菌可能痛通过分泌具有Nudix水解酶活性的效应分子Avr3b进入寄主细胞干扰植物免疫。Avr3b需要植物cyclophilin蛋白激活自身的Nudix水解酶活性。先前研究证明了大豆疫霉RXLR效应分子Avr3b在植物细胞中表达具有Nudix水解酶功能。但是,原核表达的Avr3b没有Nudix水解酶活性,将原核表达的Avr3b蛋白和植物蛋白提取物进行孵育则又恢复了 Nudix水解酶活性。针对这一现象,本研究通过进一步实验发现Avr3b 在植物中需要肽脯氨酰顺反异构酶(prolyl-peptidyl isomerase, PPIase)cyclophilin蛋白的激活。Avr3b能够直接与大豆cyclophilin蛋白GmCYPl互作,并且该激活过程依赖于 GmCYP 1 的 PPIase 活性。Avr3b 含有一个 Glycine-Proline (GP) motif,而 GP motif通常是cyclophilin蛋白与它的蛋白底物的结合位点。实验结果表明将Avr3b中GPmotif的第132位脯氨酸突变为丙氨酸会导致Avr3b和GmCYP1之间的互作减弱,突变体Avr3bP132A不再能够被GmCYP1激活同时也丧失了促进植物感病性的能力。本研究也鉴定到烟草的cyclophilin蛋白NbCYP3/4也能够与Avr3b互作并且激活它的Nudix水解酶活性。综上所述,本研究揭示了 Avr3b通过招募植物cyclophilin蛋白激活自身Nudix水解酶活性的机理。GmCYP1参与Avr3b被抗病蛋白Rps3b的识别生物学过程。大豆疫霉无毒效应分子Avr3b能够在含抗病基因Rps3b的品种上引发特异的ETI反应,为检测大豆GmCYP1蛋白是否也参与了该反应,本研究利用基因枪的方法同时向大豆细胞轰击GmCYP1的沉默载体和Avr3b的瞬时表达载体,并检测细胞死亡率。实验表明在Rps3b抗病大豆叶片的基因枪轰击区域,大豆内源GmCYP1的转录水平明显下降,同时Avr3b引起的细胞死亡显著减弱。药理学试验表明,在使用PPIase抑制剂CsA (20μM)抑制大豆叶片PPIase活性的情况下,Avr3b在含有Rps3b抗病大豆叶片上引发的细胞死亡率显著下降,同时证明Avr3b无毒功能的激活也依赖于寄主的PPIase活性。进一步试验结果显示,在抗病大豆上瞬时表达GP motif的突变体Avr3bP132A也不能够诱导Rps3b介导的细胞死亡。因此,以上结果揭示GmCYP1在Avr3b被Rps3b识别的过程中也是必需的。RXLR类Nudix蛋白是疫霉菌基因组中普遍存在的一类效应分子。无毒基因往往在疫霉菌的不同种中是不保守的,本研究接下来在多个疫霉菌基因组中开展了 Avr3b同源基因的分析。通过搜索大豆疫霉、马铃薯晚疫病菌、辣椒疫霉和橡树疫霉的基因组,我们发现这些疫霉种都含有Avr3b同源蛋白(RXLR-Nudix类效应分子),其中大豆疫霉1个、马铃薯晚疫病菌5个、辣椒疫霉1个和橡树疫霉3个,每一个RXLR-Nudix效应分子的保守的Nudix motif都位于整个效应分子的C端,但是他们的N端出现了更大的多态性。该结果提示该类效应因子可能是一类古老的效应因子,疫霉菌不同种可能利用相似的策略抑制植物免疫。真菌中也发现了分泌型的Nudix蛋白,与RXLR-Nudix效应分子不同的是,这些效应分子没有RXLRmotif或W motif。序列分析发现疫霉菌RXLR-Nudix效应分子和其他的Nudix效应分子属于不同的类别,并且各自独立进化。本研究结果表明不同类型的Nudix效应分子进化历程并不相同,提示其在不同病原菌中可能具有不同的生物学功能。