全世界的石油资源已经面临枯竭的危险，许多国家正在努力寻找可以替代石油的可再生能源。燃料乙醇是车用汽油的替代燃料，大力开发和使用燃料乙醇对能源危机的缓解，环境的保护，经济的可持续发展、农民收入的增加以及国家的安全都有着重大的意义。目前生产燃料乙醇的主要原料为淀粉类和糖质类。木质纤维素是植物利用太阳能合成的由葡萄糖聚合而成的多糖，是世界上最丰富的、可再生的生物质资源。纤维素可以在纤维素酶的作用下被降解成为葡萄糖，葡萄糖很容易在微生物的作用下发酵生成乙醇，所以，木质纤维素是最有发展潜力的燃料乙醇的生产原料。但由于目前的纤维素酶普遍存在着酶活力低、生产成本高的缺陷，用木质纤维素生产燃料乙醇至今不能真正实现工业化，开发新的纤维素酶资源一直是该领域的研究热点。自然界中，纤维素酶主要由微生物产生，草食动物依靠消化道中的微生物来分解富含纤维素的食物。盲肠是兔子等非反刍草食动物最重要的消化器官，盲肠中许多共生微生物能分泌纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶等降解植物的细胞壁。但是，迄今为止，国内外还没有从兔子盲肠中克隆到纤维素酶基因的研究报道。本文通过未培养的方法，从兔子盲肠内含物中克隆细菌的纤维素酶基因，研究兔子盲肠中纤维素酶的多样性以及它们的生化特性，为进一步挖掘兔子盲肠纤维素酶的应用潜力奠定基础。在本研究中，我们直接提取兔子盲肠内含物中微生物的混合DNA（宏基因组DNA），扩增了宏基因组DNA的16S rRNA基因，通过遗传进化分析发现，样品中大部分细菌是未研究过的细菌，它们主要来源于厚壁菌门（Firmicutes）、变形杆菌门（Proteobacteria）及拟杆菌门（Bacteroidetes）。我们用提取到的混合DNA构建了一个兔子盲肠未培养微生物的宏基因组柯斯质粒文库，文库含3.25×104个克隆，平均插入片段为35.1kb，文库总容量为1.14×109bp，文库的外源插入片段具有很好的随机性。我们对文库进行活性筛选，获得了11个表达纤维素酶活性的独立克隆，其中有4个克隆表达内切-β-1，4-D-葡聚糖酶和7个克隆表达β-葡萄糖苷酶活性。对这11个独立克隆分别进行了亚克隆和测序分析，所得到的11个纤维素酶基因与GenBank中已知的纤维素酶基因在核苷酸水平上没有明显的同源性，它们的编码产物与已知的纤维素酶的氨基酸一致性低于50％、相似性低于70％，说明本研究所克隆到的纤维素酶基因均为新的基因。由此可见，兔子盲肠是研究和发现新的纤维素酶基因的很好材料。从氨基酸序列分析得知，4个内切-β-1，4-D-葡聚糖酶均属于糖基水解酶第5家族（Glycosyl hydrolase family 5），它们都只含有一个糖基水解酶第5家族的催化功能域（Cellulase domain），而不含碳水化合物结合组件（Carbohydrate-binding module）。7个β-葡萄糖苷酶均属于糖基水解酶第3家族，它们肽链的N端均含有糖基水解酶3C功能域（Glycosyl hydrolase family 3 C-terminal domain），C端均含有糖基水解酶3功能域（Glycosyl hydrolase family 3 domain）。对11个纤维素酶阳性克隆所表达的粗酶进行了初步的酶学特性分析，其中10个纤维素酶的最适作用pH和温度分别为pH5.5～7.0和40～55℃，与兔子盲肠内的pH和温度（pH6.5和39℃）相似，说明所克隆到的纤维素酶较好地适应了兔子盲肠的内部环境。4个内切-β-1，4-D-葡聚糖酶具有广泛的底物范围，它们都能降解以β-1，3／1，6键合的葡聚糖——昆布多糖（Laminarin），这一性质在第5家族的内切葡聚糖酶中非常特别。我们用大肠杆菌BL21（DE3）过量表达了一个内切葡聚糖酶基因umcel5G和一个β-葡萄糖苷酶基因umbgl3B，纯化了表达产物，对纯化的重组酶进行了酶学性质研究。纯化后的重组内切-β-1，4-D-葡聚糖酶Umcel5G在pH5.0～9.0和温度低于55℃的条件下比较稳定，其最适作用条件为：pH6.0～6.5和55℃。该酶以随机内切的方式作用于纤维寡糖，CoCl2、CaCl2和CrCl2对该酶有激活作用，而CuCl2、ZnCl2、螯合剂EDTA和表面活性剂SDS对该酶有抑制作用。Umcel5G对CMC底物的Km值为16.07mg／ml，最大反应速度Vmax为417.5U／mg。纯化后的重组β-葡萄糖苷酶Umbgl3B在pH4.5～9.0和温度低于35℃的条件下比较稳定，其最适作用条件为：pH6.0～7.0和40℃。Umbgl3B能降解纤维二糖，对三糖以上的纤维寡糖没有作用，是个典型的β-葡萄糖苷酶。COCl2和CrCl2对该酶有较强的激活作用，CuCl2、EDTA和SDS则显著降低该酶的活力。在本课题的研究中，我们在国际上首次采用未培养方法从兔子盲肠中克隆纤维素酶基因，阐述了兔子盲肠纤维素酶的多样性，首次异源表达了克隆自兔子盲肠未培养微生物的一个内切-β-1，4-D-葡聚糖酶基因和一个β-葡萄糖苷酶基因，并较为深入地研究了这两个纤维素酶的酶学特性。