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研究背景:
目前，心血管疾病的发生率越来越高，如冠状动脉性心脏病、高血压、动脉粥样硬化、中风等，严重威胁着人们的生活质量。寻找高效低毒的防治心血管疾病的药物仍十分迫切。
钾通道是维持血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)正常膜电位和调节肌张力的重要离子通道。目前研究较清楚的钾通道主要有四种，分别是：电压依赖性钾通道(voltage-gated potassium channel，Kv)，内向整流钾通道(Inward rectifier potassium channel，Kir)，ATP敏感的钾通道(ATP-activated potassium channel，KATP)和钙激活的钾通道(Ca2+-activatedpotassiumchannel，KCa)。其中Kv和Kir在调节静息膜电位和小动脉的舒缩方面起着重要作用。研究发现，在Kv和Kir通道上有蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)的磷酸化结合位点，Kv和Kir被磷酸化后，通道活性改变，进而引起一系列的生物效应。PKC在多种心血管疾病中发挥重要作用，是调节Kv和Kir通道的重要信号通路。
木犀草素(luteolin)是一种黄酮类化合物，存在于多种药用植物和蔬菜水果中，属于食药同源性药物，它具有多种生物活性如抗氧化应激、抗肿瘤、抑制新生血管生成等。流行病学研究显示，长期服用富含木犀草素的食物可降低心血管疾病的发生。基础医学研究表明，木犀草素可抑制自发性高血压大鼠胸主动脉的重塑；对动脉粥样硬化有保护作用；可改善心肌缺血-再灌注损伤；对猪的胸主动脉和冠状动脉有显著的舒张作用。木犀草素对大鼠冠状动脉(rat coronary artery，RCA)的作用尚未有报道。木犀草素的血管舒张作用是否与激活Kv通道和Kir通道有关，其作用是否为PKC所介导尚需进一步研究。
本文将通过血管环实验观察木犀草素对RCA肌张力的影响，研究其抗收缩作用及血管舒张作用；通过膜片钳实验观察木犀草素对RCAVSMCKv和Kir通道电流的影响；通过抑制剂实验探讨木犀草素对RCA的作用是否与改变PKCs活性有关。该实验将为临床合理使用木犀草素提供基础研究资料，为研发更有效的心血管疾病防治药物提供新思路。
第一部分木犀草素对离体大鼠冠状动脉血管环的作用
目的：
1.通过观察预孵木犀草素对KCl、血栓素类似物U46619、Kv通道阻滞剂4-氨基吡啶(4-AP)、Kir通道阻滞剂BaCl2、血管加压素(VP)和CaCl2引起RCA收缩的抑制作用，研究木犀草素对各种缩血管物质收缩RCA的对抗作用强度及抗血管收缩作用的特点。
2.研究木犀草素对RCA血管环的舒张作用。
3.通过观察4-AP、BaCl2、一氧化氮合酶抑制剂L-NAME、前列腺素抑制剂吲哚美辛(Indo)及PKC抑制剂G(o)6983对木犀草素舒张RCA作用的影响探讨其作用机制。
方法：
1.离体RCA血管环的制备：大鼠用戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后，断头放血，立即取出心脏，将分离出的心脏立即放入预冷的4℃、O2饱和、PH7.4的生理盐溶液(PSS)中。在体视显微镜下小心分离冠状动脉(室间隔支、室壁支和前降支)。将分离出的冠状动脉剪成长度约为2mm的血管环。用直径为25μm的不锈钢丝沿着管腔轻轻穿过血管环，反复2~3次，机械性去除冠状动脉内皮，用两根直径25μm的不锈钢丝平行穿入血管环管腔，将血管环固定在微血管环张力记录仪(Multi Myograph System-610，DMT)的浴槽内，血管环孵育在含有5mlK-H液的浴槽内，37℃恒温，持续供氧。通过DMT拉紧钢丝，通过调节两条钢丝之间的距离将血管环的张力调整为相当于在体血压为80mmHg时的张力，温育1h后，用60mMKCl反复刺激血管环，若收缩幅度大于2mN且相邻两次收缩幅度相差不超过10%，认为血管反应和反应的重复性良好，可进行药物作用的实验观察。
2.预孵木犀草素对收缩剂引起RCA收缩的作用：待血管环在浴槽内稳定后，累积加入KCl(20、28、39、55、77、108 mM)，U46619(0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10μM)，4-AP(0.03、0.1、0.3、1、3、10、30 mM)，BaCl2(0.03、0.1、0.3、1、3、10、30 mM)，VP(0.1、0.3、1、3、10μM)。当上一个浓度所致的收缩基本达平台时再累加下一个浓度，浓度间的时间间隔一般约为4~8min。以各自最大收缩为100%，建立各收缩剂浓度-收缩量效曲线。当浓度-收缩曲线可重复时，用K-H液冲洗血管2~3次，使血管环张力恢复到基础水平。向浴槽中加入木犀草素，孵育20min后，分别在木犀草素10、30、100μM存在的情况下，再建立收缩剂的浓度-收缩曲线。以未孵育木犀草素前各收缩剂最大浓度收缩为100%，计算加入木犀草素后各收缩剂浓度对应的血管环收缩幅度百分比。比较预孵木犀草素10、30、100μM前后各抑制剂浓度收缩曲线的变化。
3.预孵木犀草素对细胞外Ca2+浓度增加所致RCA收缩的影响：待血管环在浴槽内稳定1h后，用含1mMEGTA的无钙K-H液冲洗血管环2次，并孵育20min。后用含60mMKCl(不含EGTA)的无钙K-H液置换浴槽内的液体，血管稳定10min后，累积加入CaCl2，使浴槽内PSS的Ca2+浓度依次为0.03、0.1、0.3、1、3、10、30mM，记录不同浓度Ca2+引起血管环收缩的幅度。当上一个Ca2+浓度所致的收缩基本达平台时再累加下一个浓度，浓度间的时间间隔一般约为4-8min。建立Ca2+的浓度-收缩曲线。然后用K-H液冲洗血管环2~3次，待血管环的张力恢复到正常，在浴槽中预孵各浓度木犀草素(10、30、100μM)20min后重新建立Ca2+浓度-收缩曲线。以未孵育木犀草素前30mMCaCl2引起的血管收缩为100%，计算不同浓度CaCl2收缩RCA的百分比。绘制量效曲线，比较预孵木犀草素10、30、100μM前后CaCl2的量效曲线变化。
4.木犀草素对RCA预收缩的作用：用60mMKCl和(或)0.3μMU46619刺激血管环收缩，当血管收缩达到平台时，加入相应DMSO作为溶剂对照。浴槽中DMSO的浓度与不同浓度木犀草素存在时浴槽内的DMSO的浓度一致。记录血管环的张力，观察木犀草素溶剂对RCA肌张力的影响。约20min后，用K-H液冲洗血管2~3次，使血管恢复到未加KCl或U46619时的张力。然后用60mMKCl或0.3μMU46619预收缩血管环，当收缩达到平台时，累积加入木犀草素使其浴槽内的终浓度依次为1、3、10、30和100μM。加药时间间隔约为5~8min，记录木犀草素各浓度对血管环张力的影响，最后分别以60mMKCl或0.3μMU46619预收缩为100%，计算各浓度木犀草素的舒张百分比，绘制木犀草素的浓度-舒张曲线。
5.抑制剂实验：本文观察了Kv通道抑制剂4-氨基吡啶(4-AP)、Kir通道抑制剂BaCl2、一氧化氮合成酶抑制剂L-NAME、前列腺素合成酶抑制剂吲哚美辛(Indo)及PKC抑制剂G(o)6983对木犀草素舒张离体RCA的作用。用0.3μMU46619刺激血管收缩，血管环收缩达平台时，加入30μM木犀草素，记录血管的张力变化，用K-H液冲洗血管环2~3次，等待血管环张力恢复到基础张力。在同一根血管上，再次用0.3μMU46619刺激收缩血管，当血管环收缩达平台时，分别加入4-AP、BaCl2、L-NAME、Indo或G(o)6983，使抑制剂的终浓度分别为1mM、0.3mM、0.1mM、0.01mM、1μM。加抑制剂后孵育约10min，再加入30μM木犀草素，记录血管环张力变化，比较加抑制剂前后木犀草素(30μM)对血管环的舒张百分比。
结果：
1.预孵木犀草素对收缩剂及细胞外Ca2+增加所致RCA收缩的作用：KCl(20~108mM)、U46619(0.01~10μM)、BaCl2(0.05~30mM)、4-AP(0.05~30mM)、VP(0.1~10μΜ)和细胞外Ca2+(0.03~30mM)均可浓度依赖性地引起血管收缩。KCl、U46619、BaCl2、4-AP、VP、细胞外Ca2+引起的最大收缩分别为11.50±2.37mN、4.97±1.68mN、6.25±2.95mN、7.92±2.63mN、6.72±3.03mN和6.74±3.24mN，其半数有效量(EC50)分别为34.69±1.04mM、0.24±1.30μM、0.27±3.07mM、0.18±2.61mM、1.80±1.67μM和0.74±1.18mM。木犀草素在10、30、100μM时可使KCl、U46619、BaCl2、4-AP、VP、细胞外Ca2+引起的最大收缩幅度减小，并使收缩量效曲线非平行右移。木犀草素对KCl、U46619、BaCl2、4-AP、VP、Ca2+引起RCA收缩的半数抑制浓度(IC50)分别为14.82±1.45μM、10.99±1.51μM、11.07±1.44μM、9.40±1.29μM、14.02±3.12μM和13.45±4.10μM。
2.木犀草素对RCA预收缩的作用：60mMKCl或0.3μMU46619刺激RCA血管收缩，收缩幅度分别为4.27±1.68mN和5.27±1.95mN。当60mMKCl刺激时，木犀草素1、3、10、30、100μM舒张RCA的百分比分别为1.17±2.41%，0.48±3.58%，29.63±17.97%，77.04±27.97%，101.9±6.56%，木犀草素10、30、100μM可显著舒张60mMKCl预收缩的RCA(P＜0.05)。以0.3μMU46619刺激血管收缩时，木犀草素1、3、10、30、100μM舒张RCA的百分比分别为2.70±5.19%、11.42±8.39%、66.22±21.20%、106.90±7.68%、108.21±7.15%，木犀草素10、30、100μM可显著舒张0.3μMU46619预收缩的RCA(P＜0.05)。
3.4-AP、BaCl2、L-NAME、Indo及G(o)6983对木犀草素舒张离体RCA的作用：以0.3μMU46619刺激RCA血管收缩，未加抑制剂时30μM木犀草素舒张RCA的百分比为78.10±6.67%。加4-AP(10 mM)后，木犀草素对RCA的舒张作用显著减弱(41.05±11.14%vs.78.10±6.67%，P＜0.05)；BaCl2(0.3 mM)显著减弱木犀草素对RCA的舒张作用(62.70±12.88%vs.78.10±6.67%，P＜0.05)；G(o)6983(1μM)显著减弱木犀草素对RCA的舒张作用(51.54±8.27%vs.78.10±6.67%，P＜0.05)；L-NAME(0.1 mM)对木犀草素所致RCA的舒张作用无显著影响(78.10±6.67%vs.77.52±10.44%，P＞0.05)；Indo(0.01 mM)对木犀草素所致RCA舒张作用无显著影响(78.10±6.67%vs.75.91±17.69%，P＞0.05)。
结论：
1.木犀草素浓度依赖性地抑制KCl(20~108mM)、U46619(0.01~10μM)、BaCl2(0.05~30mM)、4-AP(0.05~30mM)、VP(0.1~10μΜ)和细胞外Ca2+(0.03~30mM)刺激引起的RCA收缩，使浓度-收缩曲线非平行右移，并减小最大收缩幅度。对各种血管收缩剂的对抗作用强度相近，对收缩剂没有明显的选择性。
2.木犀草素在10~100μM浓度依赖性地舒张60mMKCl和0.3μMU46619引起的RCA预收缩；Kv通道抑制剂4-AP(10 mM)和Kir通道抑制剂BaCl2(0.3 mM)可抑制木犀草素(30μM)引起的RCA舒张，提示木犀草素舒张RCA的作用可能与激活Kv和Kir通道有关；PKC抑制剂G(o)6983(1μM)显著抑制木犀草素(30μM)引起的RCA舒张，提示木犀草素舒张RCA作用可能与改变PKC活性有关。而L-NAME(0.1 mM)和Indo(0.01 mM)对木犀草素舒张RCA作用无显著影响，提示木犀草素对RCA的舒张作用与一氧化氮合成和前列腺素合成无关。
第二部分木犀草素对大鼠冠状动脉平滑肌细胞Kv通道电流的影响
目的：
观察木犀草素对急性分离的大鼠冠状动脉平滑肌细胞(rat coronary arterial smooth muscle cells，RCASMC)Kv电流的影响。
2.观察PKC抑制剂G(o)6983对木犀草素增大RCASMCKv电流的影响。
方法：
1.RCASMCs的分离：将去内皮的冠状动脉段放入细胞酶解液Ⅰ(细胞分离液中加入0.5mg/ml木瓜酶，1mg/ml胎牛血清和1mg/ml苏糖醇)中，在37℃，持续供氧的条件下孵育18~20min，后将冠状动脉段转移到酶解液Ⅱ(细胞分离液中加入1mg/ml的胎牛血清，0.5mg/ml胶原蛋白F和0.5mg/ml胶原H)中，在37℃，持续供氧的条件下孵育5~8分钟，细胞悬液离心2次，弃掉上清，得新鲜分离的RCASMCs。
2.Kv电流的记录
将记录模式设置为电压钳模式，将电压钳制在-60mV，去极化电压程序从-60mV~+60mV，步阶为10mV，去极化电压时程为500ms，记录Kv电流。在现有的实验条件下，电极内液中含有高浓度的ATP(5 mM)和EGTA(10 mM )以消除KATP和Kca电流。Kv电极内液组成：110KCl，1.2MgCl2，5Na2ATP，10EGTA，10HEPES，用KOH调节pH=7.2。Kv灌流液组成：135NaCl，5KCl，2MgCl2，5HEPES，10D-glucose，pH=7.4。实验结果用电流密度表示(pA/pF )，电流除以细胞电容即得出该细胞的电流密度。全细胞膜片钳采用高性能的Axopatch200B放大器进行，用Clampfit10.4对电流进行数据分析。低通滤波为1kHZ，采样率为10kHZ。
3.实验内容：
(1)为了观察木犀草素对RCASMCKv电流的浓度依赖性作用，待正常的Kv电流稳定后，在细胞槽中累积加入不同浓度的木犀草素，使木犀草素的终浓度为10、30、100μM，每加入一个木犀草素的浓度2min后，记录Kv电流，当电流稳定后再加入下一个浓度。另外观察在单电压(+60mV)刺激下不同浓度木犀草素(10、30、100μM)对Kv电流的影响。
(2)进一步鉴别木犀草素对Kv电流的增大作用，实验分组：正常Kv电流组(control组)，100μM木犀草素组(control+luteolin100μM)，100μM木犀草素+4-AP3mM组，100μM木犀草素+4-AP10mM组。
(3)为了研究PKC抑制剂G(o)6983对木犀草素增大Kv电流的影响，待正常电流稳定后，在细胞槽中加入G(o)69831μM，预孵5min，在此基础上，加入木犀草素30μM，2min后记录Kv电流。
结果：
1.用去极化电压程序-60mV~+60mV刺激引起电流，以刺激电压为横坐标，电流密度为纵坐标，绘制I-V曲线，与正常对照组相比，在0mV~+60mV范围内，木犀草素10、30、100μM浓度依赖性的增大Kv电流(P＜0.05)，使I-V曲线上移。在+60mV单电压刺激下，RCASMCKv电流峰值为865.97±211.17pA，电流密度为35.50±6.06pA/pF(n=6)。加入木犀草素10、30、100μM后电流密度分别为58.25±9.70pA/pF、69.26±18.02pA/pF、105.6±15.61pA/pF。与正常组比较，电流密度增加幅度分别为36.64±11.45%(P＜0.05)、75.86±8.45%(P＜0.05)、105.6±7.23%(P＜0.05)。
2.3mM4-AP和10mM4-AP显著减小了100μM木犀草素引起的Kv电流的增加，在+60mV时，其减少百分比分别为23.6±4.07%和47.76±6.19%，Means±SD，n=6(P＜0.05)。
3.用去极化电压程序-60mV~+60mV刺激引起电流，绘制I-V曲线。在+60mV检测电压下，与正常对照组相比，木犀草素(30μM)显著增加了Kv电流密度(73.81±7.13pA/pFvs.35.88±4.45pA/pF，P＜0.05)；G(o)6983(1μM)组与木犀草素组相比有显著差异(40.96±4.07pA/pFvs.73.81±7.13pA/pF，P＜0.05)，说明G(o)6983(1μM)显著抑制木犀草素增大Kv电流的作用。
结论：
1.在0~+60mV范围，木犀草素浓度依赖性地(10~100μM)增大RCASMCKv电流，使I-V曲线上移。
2.PKC抑制剂G(o)69831μM可显著抑制木犀草素(30μM)引起的Kv电流增大。提示木犀草素增大Kv电流可能与PKC通路有关。
第三部分木犀草素对大鼠冠状动脉平滑肌细胞Kir通道电流的影响
目的：
1.观察木犀草素对急性分离的大鼠冠状动脉平滑肌细胞(rat coronary arterial smooth muscle cells，RCASMC)Kir电流的影响。
2.观察PKC抑制剂G(o)6983对木犀草素增大RCASMCKir电流的影响。
方法：
1.RCASMCs的分离：将去内皮的冠状动脉段放入细胞酶解液Ⅰ(细胞分离液中加入0.5mg/ml木瓜酶，1mg/ml胎牛血清和1mg/ml苏糖醇)中，在37℃，持续供氧的条件下孵育18~20min，后将冠状动脉段转移到酶解液Ⅱ(细胞分离液中加入1mg/ml的胎牛血清，0.5mg/ml胶原蛋白F和0.5mg/ml胶原H)中，在37℃，持续供氧的条件下孵育5~8分钟，细胞悬液离心2次，弃掉上清，得新鲜分离的RCASMCs。
2.Kir电流的记录
Kir电流记录采用全细胞膜片钳技术，去极化电压程序：去极化刺激电压从-140mV以20mV步阶逐渐增加到+20mV，电压时程为500ms，记录Kir电流。所用电极内液为Kir电极内液，灌流液为Kir灌流液，Kir电极内液组成：100potassium–D-gluconate，30KCl，1MgCl2，1EGTA，15HEPES，1Na2-ATP。Kir灌流液组成：12NaCl，130KCl，1MgCl2，2NaHCO3，0.4KH2PO4，0.3NaH2PO4，1.8CaCl2，10HEPES，5.5glucose，pH=7.4。
实验结果用电流密度表示(pA/pF )，电流强度除以细胞电容即得出该细胞的电流密度。全细胞膜片钳采用高性能的Axopatch200B放大器进行，用Clampfit10.4对电流进行数据分析。低通滤波为1kHZ，采样率为10kHZ。
3.实验内容：
(1)为了研究木犀草素对RCASMCKir电流的浓度依赖性，用去极化电压程序记录Kir电流，待正常电流稳定后，向细胞槽中加入不同浓度的木犀草素(10、30、100μM)，每加一个浓度后2min记录Kir电流。另外在单电压(-140 mV )刺激下观察不同浓度木犀草素(10、30、100μM)对Kir电流的影响。
(2)为了鉴别木犀草素对Kir电流的增大作用，在记录正常Kir电流的基础上记录了加BaCl2(300μM)，木犀草素(100μM)，木犀草素(100μM)+BaCl2(300μM)时的Kir电流。
(3)为了检测PKC抑制剂G(o)6983在木犀草素增大Kir电流中的作用，待Kir正常电流稳定后，向细胞槽中加入G(o)69831μM预孵5min后，再加入30μM木犀草素，稳定2min后记录Kir电流。
结果：
1.在去极化电压程序-140mV~+20mV检测Kir电流，绘制I-V曲线。与对照组相比，木犀草素在10μΜ时对Kir电流没有显著影响，在30μΜ和100μΜ时，能显著增加Kir电流(-140~-60mV)，使I-V曲线下移。在测试电压为-140mV时，正常Kir电流密度为-7.12±2.21pA/pF，加入木犀草素10、30、100μΜ后电流密度分别为-8.21±3.23pA/pF、-11.54±3.98pA/pF、-16.09±3.08pA/pF。与正常组相比，加入木犀草素30、100μΜ显著增加了电流密度，增加幅度分别为66.73±9.41%(P＜0.05)、125.92±11.36%(P＜0.05)。加入木犀草素10μΜ后对电流密度无显著影响，增加幅度为13.54±8.52%(P＞0.05)。
2.在-140mV时，与正常组比较，BaCl2(300μM)显著抑制了Kir电流(P＜0.05)，也显著抑制了木犀草素(100μM)引起的Kir电流增大(P＜0.05)。300μΜBa2+抑制control组Kir电流的百分比为80.21±10.44%；300μΜBa2+抑制木犀草素(100μM)引起的Kir净电流增大百分比为42.14±5.28%。
3.用去极化电压程序-140mV~+20mV刺激引起电流，在-140mV检测电压下，与正常对照组相比，木犀草素(100μM)显著增加了Kir电流密度(16.09±3.08pA/pFvs.7.12±2.21pA/pF，P＜0.05)；G(o)6983(1μM)组与木犀草素(100μM)组相比有显著差异(11.54±3.98pA/pFvs.16.09±3.08pA/pF，P＜0.05)，G(o)6983(1μM)显著抑制了木犀草素引起的Kir电流增大(P＜0.05)。
结论：
1.在-140~-60mV范围内，木犀草素浓度依赖性地(30~100μM)增大Ba2+敏感的RCASMCKir电流，并使I-V曲线下移(负值增大)。
2.PKC抑制剂G(o)69831μM可显著抑制木犀草素(100μM)引起的Kir电流增大。提示木犀草素引起Kir电流增大可能与PKC通路有关。
目前，心血管疾病的发生率越来越高，如冠状动脉性心脏病、高血压、动脉粥样硬化、中风等，严重威胁着人们的生活质量。寻找高效低毒的防治心血管疾病的药物仍十分迫切。
钾通道是维持血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)正常膜电位和调节肌张力的重要离子通道。目前研究较清楚的钾通道主要有四种，分别是：电压依赖性钾通道(voltage-gated potassium channel，Kv)，内向整流钾通道(Inward rectifier potassium channel，Kir)，ATP敏感的钾通道(ATP-activated potassium channel，KATP)和钙激活的钾通道(Ca2+-activatedpotassiumchannel，KCa)。其中Kv和Kir在调节静息膜电位和小动脉的舒缩方面起着重要作用。研究发现，在Kv和Kir通道上有蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)的磷酸化结合位点，Kv和Kir被磷酸化后，通道活性改变，进而引起一系列的生物效应。PKC在多种心血管疾病中发挥重要作用，是调节Kv和Kir通道的重要信号通路。
木犀草素(luteolin)是一种黄酮类化合物，存在于多种药用植物和蔬菜水果中，属于食药同源性药物，它具有多种生物活性如抗氧化应激、抗肿瘤、抑制新生血管生成等。流行病学研究显示，长期服用富含木犀草素的食物可降低心血管疾病的发生。基础医学研究表明，木犀草素可抑制自发性高血压大鼠胸主动脉的重塑；对动脉粥样硬化有保护作用；可改善心肌缺血-再灌注损伤；对猪的胸主动脉和冠状动脉有显著的舒张作用。木犀草素对大鼠冠状动脉(rat coronary artery，RCA)的作用尚未有报道。木犀草素的血管舒张作用是否与激活Kv通道和Kir通道有关，其作用是否为PKC所介导尚需进一步研究。
本文将通过血管环实验观察木犀草素对RCA肌张力的影响，研究其抗收缩作用及血管舒张作用；通过膜片钳实验观察木犀草素对RCAVSMCKv和Kir通道电流的影响；通过抑制剂实验探讨木犀草素对RCA的作用是否与改变PKCs活性有关。该实验将为临床合理使用木犀草素提供基础研究资料，为研发更有效的心血管疾病防治药物提供新思路。
第一部分木犀草素对离体大鼠冠状动脉血管环的作用
目的：
1.通过观察预孵木犀草素对KCl、血栓素类似物U46619、Kv通道阻滞剂4-氨基吡啶(4-AP)、Kir通道阻滞剂BaCl2、血管加压素(VP)和CaCl2引起RCA收缩的抑制作用，研究木犀草素对各种缩血管物质收缩RCA的对抗作用强度及抗血管收缩作用的特点。
2.研究木犀草素对RCA血管环的舒张作用。
3.通过观察4-AP、BaCl2、一氧化氮合酶抑制剂L-NAME、前列腺素抑制剂吲哚美辛(Indo)及PKC抑制剂G(o)6983对木犀草素舒张RCA作用的影响探讨其作用机制。
方法：
1.离体RCA血管环的制备：大鼠用戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后，断头放血，立即取出心脏，将分离出的心脏立即放入预冷的4℃、O2饱和、PH7.4的生理盐溶液(PSS)中。在体视显微镜下小心分离冠状动脉(室间隔支、室壁支和前降支)。将分离出的冠状动脉剪成长度约为2mm的血管环。用直径为25μm的不锈钢丝沿着管腔轻轻穿过血管环，反复2~3次，机械性去除冠状动脉内皮，用两根直径25μm的不锈钢丝平行穿入血管环管腔，将血管环固定在微血管环张力记录仪(Multi Myograph System-610，DMT)的浴槽内，血管环孵育在含有5mlK-H液的浴槽内，37℃恒温，持续供氧。通过DMT拉紧钢丝，通过调节两条钢丝之间的距离将血管环的张力调整为相当于在体血压为80mmHg时的张力，温育1h后，用60mMKCl反复刺激血管环，若收缩幅度大于2mN且相邻两次收缩幅度相差不超过10%，认为血管反应和反应的重复性良好，可进行药物作用的实验观察。
2.预孵木犀草素对收缩剂引起RCA收缩的作用：待血管环在浴槽内稳定后，累积加入KCl(20、28、39、55、77、108 mM)，U46619(0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10μM)，4-AP(0.03、0.1、0.3、1、3、10、30 mM)，BaCl2(0.03、0.1、0.3、1、3、10、30 mM)，VP(0.1、0.3、1、3、10μM)。当上一个浓度所致的收缩基本达平台时再累加下一个浓度，浓度间的时间间隔一般约为4~8min。以各自最大收缩为100%，建立各收缩剂浓度-收缩量效曲线。当浓度-收缩曲线可重复时，用K-H液冲洗血管2~3次，使血管环张力恢复到基础水平。向浴槽中加入木犀草素，孵育20min后，分别在木犀草素10、30、100μM存在的情况下，再建立收缩剂的浓度-收缩曲线。以未孵育木犀草素前各收缩剂最大浓度收缩为100%，计算加入木犀草素后各收缩剂浓度对应的血管环收缩幅度百分比。比较预孵木犀草素10、30、100μM前后各抑制剂浓度收缩曲线的变化。
3.预孵木犀草素对细胞外Ca2+浓度增加所致RCA收缩的影响：待血管环在浴槽内稳定1h后，用含1mMEGTA的无钙K-H液冲洗血管环2次，并孵育20min。后用含60mMKCl(不含EGTA)的无钙K-H液置换浴槽内的液体，血管稳定10min后，累积加入CaCl2，使浴槽内PSS的Ca2+浓度依次为0.03、0.1、0.3、1、3、10、30mM，记录不同浓度Ca2+引起血管环收缩的幅度。当上一个Ca2+浓度所致的收缩基本达平台时再累加下一个浓度，浓度间的时间间隔一般约为4-8min。建立Ca2+的浓度-收缩曲线。然后用K-H液冲洗血管环2~3次，待血管环的张力恢复到正常，在浴槽中预孵各浓度木犀草素(10、30、100μM)20min后重新建立Ca2+浓度-收缩曲线。以未孵育木犀草素前30mMCaCl2引起的血管收缩为100%，计算不同浓度CaCl2收缩RCA的百分比。绘制量效曲线，比较预孵木犀草素10、30、100μM前后CaCl2的量效曲线变化。
4.木犀草素对RCA预收缩的作用：用60mMKCl和(或)0.3μMU46619刺激血管环收缩，当血管收缩达到平台时，加入相应DMSO作为溶剂对照。浴槽中DMSO的浓度与不同浓度木犀草素存在时浴槽内的DMSO的浓度一致。记录血管环的张力，观察木犀草素溶剂对RCA肌张力的影响。约20min后，用K-H液冲洗血管2~3次，使血管恢复到未加KCl或U46619时的张力。然后用60mMKCl或0.3μMU46619预收缩血管环，当收缩达到平台时，累积加入木犀草素使其浴槽内的终浓度依次为1、3、10、30和100μM。加药时间间隔约为5~8min，记录木犀草素各浓度对血管环张力的影响，最后分别以60mMKCl或0.3μMU46619预收缩为100%，计算各浓度木犀草素的舒张百分比，绘制木犀草素的浓度-舒张曲线。
5.抑制剂实验：本文观察了Kv通道抑制剂4-氨基吡啶(4-AP)、Kir通道抑制剂BaCl2、一氧化氮合成酶抑制剂L-NAME、前列腺素合成酶抑制剂吲哚美辛(Indo)及PKC抑制剂G(o)6983对木犀草素舒张离体RCA的作用。用0.3μMU46619刺激血管收缩，血管环收缩达平台时，加入30μM木犀草素，记录血管的张力变化，用K-H液冲洗血管环2~3次，等待血管环张力恢复到基础张力。在同一根血管上，再次用0.3μMU46619刺激收缩血管，当血管环收缩达平台时，分别加入4-AP、BaCl2、L-NAME、Indo或G(o)6983，使抑制剂的终浓度分别为1mM、0.3mM、0.1mM、0.01mM、1μM。加抑制剂后孵育约10min，再加入30μM木犀草素，记录血管环张力变化，比较加抑制剂前后木犀草素(30μM)对血管环的舒张百分比。
结果：
1.预孵木犀草素对收缩剂及细胞外Ca2+增加所致RCA收缩的作用：KCl(20~108mM)、U46619(0.01~10μM)、BaCl2(0.05~30mM)、4-AP(0.05~30mM)、VP(0.1~10μΜ)和细胞外Ca2+(0.03~30mM)均可浓度依赖性地引起血管收缩。KCl、U46619、BaCl2、4-AP、VP、细胞外Ca2+引起的最大收缩分别为11.50±2.37mN、4.97±1.68mN、6.25±2.95mN、7.92±2.63mN、6.72±3.03mN和6.74±3.24mN，其半数有效量(EC50)分别为34.69±1.04mM、0.24±1.30μM、0.27±3.07mM、0.18±2.61mM、1.80±1.67μM和0.74±1.18mM。木犀草素在10、30、100μM时可使KCl、U46619、BaCl2、4-AP、VP、细胞外Ca2+引起的最大收缩幅度减小，并使收缩量效曲线非平行右移。木犀草素对KCl、U46619、BaCl2、4-AP、VP、Ca2+引起RCA收缩的半数抑制浓度(IC50)分别为14.82±1.45μM、10.99±1.51μM、11.07±1.44μM、9.40±1.29μM、14.02±3.12μM和13.45±4.10μM。
2.木犀草素对RCA预收缩的作用：60mMKCl或0.3μMU46619刺激RCA血管收缩，收缩幅度分别为4.27±1.68mN和5.27±1.95mN。当60mMKCl刺激时，木犀草素1、3、10、30、100μM舒张RCA的百分比分别为1.17±2.41%，0.48±3.58%，29.63±17.97%，77.04±27.97%，101.9±6.56%，木犀草素10、30、100μM可显著舒张60mMKCl预收缩的RCA(P＜0.05)。以0.3μMU46619刺激血管收缩时，木犀草素1、3、10、30、100μM舒张RCA的百分比分别为2.70±5.19%、11.42±8.39%、66.22±21.20%、106.90±7.68%、108.21±7.15%，木犀草素10、30、100μM可显著舒张0.3μMU46619预收缩的RCA(P＜0.05)。
3.4-AP、BaCl2、L-NAME、Indo及G(o)6983对木犀草素舒张离体RCA的作用：以0.3μMU46619刺激RCA血管收缩，未加抑制剂时30μM木犀草素舒张RCA的百分比为78.10±6.67%。加4-AP(10 mM)后，木犀草素对RCA的舒张作用显著减弱(41.05±11.14%vs.78.10±6.67%，P＜0.05)；BaCl2(0.3 mM)显著减弱木犀草素对RCA的舒张作用(62.70±12.88%vs.78.10±6.67%，P＜0.05)；G(o)6983(1μM)显著减弱木犀草素对RCA的舒张作用(51.54±8.27%vs.78.10±6.67%，P＜0.05)；L-NAME(0.1 mM)对木犀草素所致RCA的舒张作用无显著影响(78.10±6.67%vs.77.52±10.44%，P＞0.05)；Indo(0.01 mM)对木犀草素所致RCA舒张作用无显著影响(78.10±6.67%vs.75.91±17.69%，P＞0.05)。
结论：
1.木犀草素浓度依赖性地抑制KCl(20~108mM)、U46619(0.01~10μM)、BaCl2(0.05~30mM)、4-AP(0.05~30mM)、VP(0.1~10μΜ)和细胞外Ca2+(0.03~30mM)刺激引起的RCA收缩，使浓度-收缩曲线非平行右移，并减小最大收缩幅度。对各种血管收缩剂的对抗作用强度相近，对收缩剂没有明显的选择性。
2.木犀草素在10~100μM浓度依赖性地舒张60mMKCl和0.3μMU46619引起的RCA预收缩；Kv通道抑制剂4-AP(10 mM)和Kir通道抑制剂BaCl2(0.3 mM)可抑制木犀草素(30μM)引起的RCA舒张，提示木犀草素舒张RCA的作用可能与激活Kv和Kir通道有关；PKC抑制剂G(o)6983(1μM)显著抑制木犀草素(30μM)引起的RCA舒张，提示木犀草素舒张RCA作用可能与改变PKC活性有关。而L-NAME(0.1 mM)和Indo(0.01 mM)对木犀草素舒张RCA作用无显著影响，提示木犀草素对RCA的舒张作用与一氧化氮合成和前列腺素合成无关。
第二部分木犀草素对大鼠冠状动脉平滑肌细胞Kv通道电流的影响
目的：
观察木犀草素对急性分离的大鼠冠状动脉平滑肌细胞(rat coronary arterial smooth muscle cells，RCASMC)Kv电流的影响。
2.观察PKC抑制剂G(o)6983对木犀草素增大RCASMCKv电流的影响。
方法：
1.RCASMCs的分离：将去内皮的冠状动脉段放入细胞酶解液Ⅰ(细胞分离液中加入0.5mg/ml木瓜酶，1mg/ml胎牛血清和1mg/ml苏糖醇)中，在37℃，持续供氧的条件下孵育18~20min，后将冠状动脉段转移到酶解液Ⅱ(细胞分离液中加入1mg/ml的胎牛血清，0.5mg/ml胶原蛋白F和0.5mg/ml胶原H)中，在37℃，持续供氧的条件下孵育5~8分钟，细胞悬液离心2次，弃掉上清，得新鲜分离的RCASMCs。
2.Kv电流的记录
将记录模式设置为电压钳模式，将电压钳制在-60mV，去极化电压程序从-60mV~+60mV，步阶为10mV，去极化电压时程为500ms，记录Kv电流。在现有的实验条件下，电极内液中含有高浓度的ATP(5 mM)和EGTA(10 mM )以消除KATP和Kca电流。Kv电极内液组成：110KCl，1.2MgCl2，5Na2ATP，10EGTA，10HEPES，用KOH调节pH=7.2。Kv灌流液组成：135NaCl，5KCl，2MgCl2，5HEPES，10D-glucose，pH=7.4。实验结果用电流密度表示(pA/pF )，电流除以细胞电容即得出该细胞的电流密度。全细胞膜片钳采用高性能的Axopatch200B放大器进行，用Clampfit10.4对电流进行数据分析。低通滤波为1kHZ，采样率为10kHZ。
3.实验内容：
(1)为了观察木犀草素对RCASMCKv电流的浓度依赖性作用，待正常的Kv电流稳定后，在细胞槽中累积加入不同浓度的木犀草素，使木犀草素的终浓度为10、30、100μM，每加入一个木犀草素的浓度2min后，记录Kv电流，当电流稳定后再加入下一个浓度。另外观察在单电压(+60mV)刺激下不同浓度木犀草素(10、30、100μM)对Kv电流的影响。
(2)进一步鉴别木犀草素对Kv电流的增大作用，实验分组：正常Kv电流组(control组)，100μM木犀草素组(control+luteolin100μM)，100μM木犀草素+4-AP3mM组，100μM木犀草素+4-AP10mM组。
(3)为了研究PKC抑制剂G(o)6983对木犀草素增大Kv电流的影响，待正常电流稳定后，在细胞槽中加入G(o)69831μM，预孵5min，在此基础上，加入木犀草素30μM，2min后记录Kv电流。
结果：
1.用去极化电压程序-60mV~+60mV刺激引起电流，以刺激电压为横坐标，电流密度为纵坐标，绘制I-V曲线，与正常对照组相比，在0mV~+60mV范围内，木犀草素10、30、100μM浓度依赖性的增大Kv电流(P＜0.05)，使I-V曲线上移。在+60mV单电压刺激下，RCASMCKv电流峰值为865.97±211.17pA，电流密度为35.50±6.06pA/pF(n=6)。加入木犀草素10、30、100μM后电流密度分别为58.25±9.70pA/pF、69.26±18.02pA/pF、105.6±15.61pA/pF。与正常组比较，电流密度增加幅度分别为36.64±11.45%(P＜0.05)、75.86±8.45%(P＜0.05)、105.6±7.23%(P＜0.05)。
2.3mM4-AP和10mM4-AP显著减小了100μM木犀草素引起的Kv电流的增加，在+60mV时，其减少百分比分别为23.6±4.07%和47.76±6.19%，Means±SD，n=6(P＜0.05)。
3.用去极化电压程序-60mV~+60mV刺激引起电流，绘制I-V曲线。在+60mV检测电压下，与正常对照组相比，木犀草素(30μM)显著增加了Kv电流密度(73.81±7.13pA/pFvs.35.88±4.45pA/pF，P＜0.05)；G(o)6983(1μM)组与木犀草素组相比有显著差异(40.96±4.07pA/pFvs.73.81±7.13pA/pF，P＜0.05)，说明G(o)6983(1μM)显著抑制木犀草素增大Kv电流的作用。
结论：
1.在0~+60mV范围，木犀草素浓度依赖性地(10~100μM)增大RCASMCKv电流，使I-V曲线上移。
2.PKC抑制剂G(o)69831μM可显著抑制木犀草素(30μM)引起的Kv电流增大。提示木犀草素增大Kv电流可能与PKC通路有关。
第三部分木犀草素对大鼠冠状动脉平滑肌细胞Kir通道电流的影响
目的：
1.观察木犀草素对急性分离的大鼠冠状动脉平滑肌细胞(rat coronary arterial smooth muscle cells，RCASMC)Kir电流的影响。
2.观察PKC抑制剂G(o)6983对木犀草素增大RCASMCKir电流的影响。
方法：
1.RCASMCs的分离：将去内皮的冠状动脉段放入细胞酶解液Ⅰ(细胞分离液中加入0.5mg/ml木瓜酶，1mg/ml胎牛血清和1mg/ml苏糖醇)中，在37℃，持续供氧的条件下孵育18~20min，后将冠状动脉段转移到酶解液Ⅱ(细胞分离液中加入1mg/ml的胎牛血清，0.5mg/ml胶原蛋白F和0.5mg/ml胶原H)中，在37℃，持续供氧的条件下孵育5~8分钟，细胞悬液离心2次，弃掉上清，得新鲜分离的RCASMCs。
2.Kir电流的记录
Kir电流记录采用全细胞膜片钳技术，去极化电压程序：去极化刺激电压从-140mV以20mV步阶逐渐增加到+20mV，电压时程为500ms，记录Kir电流。所用电极内液为Kir电极内液，灌流液为Kir灌流液，Kir电极内液组成：100potassium–D-gluconate，30KCl，1MgCl2，1EGTA，15HEPES，1Na2-ATP。Kir灌流液组成：12NaCl，130KCl，1MgCl2，2NaHCO3，0.4KH2PO4，0.3NaH2PO4，1.8CaCl2，10HEPES，5.5glucose，pH=7.4。
实验结果用电流密度表示(pA/pF )，电流强度除以细胞电容即得出该细胞的电流密度。全细胞膜片钳采用高性能的Axopatch200B放大器进行，用Clampfit10.4对电流进行数据分析。低通滤波为1kHZ，采样率为10kHZ。
3.实验内容：
(1)为了研究木犀草素对RCASMCKir电流的浓度依赖性，用去极化电压程序记录Kir电流，待正常电流稳定后，向细胞槽中加入不同浓度的木犀草素(10、30、100μM)，每加一个浓度后2min记录Kir电流。另外在单电压(-140 mV )刺激下观察不同浓度木犀草素(10、30、100μM)对Kir电流的影响。
(2)为了鉴别木犀草素对Kir电流的增大作用，在记录正常Kir电流的基础上记录了加BaCl2(300μM)，木犀草素(100μM)，木犀草素(100μM)+BaCl2(300μM)时的Kir电流。
(3)为了检测PKC抑制剂G(o)6983在木犀草素增大Kir电流中的作用，待Kir正常电流稳定后，向细胞槽中加入G(o)69831μM预孵5min后，再加入30μM木犀草素，稳定2min后记录Kir电流。
结果：
1.在去极化电压程序-140mV~+20mV检测Kir电流，绘制I-V曲线。与对照组相比，木犀草素在10μΜ时对Kir电流没有显著影响，在30μΜ和100μΜ时，能显著增加Kir电流(-140~-60mV)，使I-V曲线下移。在测试电压为-140mV时，正常Kir电流密度为-7.12±2.21pA/pF，加入木犀草素10、30、100μΜ后电流密度分别为-8.21±3.23pA/pF、-11.54±3.98pA/pF、-16.09±3.08pA/pF。与正常组相比，加入木犀草素30、100μΜ显著增加了电流密度，增加幅度分别为66.73±9.41%(P＜0.05)、125.92±11.36%(P＜0.05)。加入木犀草素10μΜ后对电流密度无显著影响，增加幅度为13.54±8.52%(P＞0.05)。
2.在-140mV时，与正常组比较，BaCl2(300μM)显著抑制了Kir电流(P＜0.05)，也显著抑制了木犀草素(100μM)引起的Kir电流增大(P＜0.05)。300μΜBa2+抑制control组Kir电流的百分比为80.21±10.44%；300μΜBa2+抑制木犀草素(100μM)引起的Kir净电流增大百分比为42.14±5.28%。
3.用去极化电压程序-140mV~+20mV刺激引起电流，在-140mV检测电压下，与正常对照组相比，木犀草素(100μM)显著增加了Kir电流密度(16.09±3.08pA/pFvs.7.12±2.21pA/pF，P＜0.05)；G(o)6983(1μM)组与木犀草素(100μM)组相比有显著差异(11.54±3.98pA/pFvs.16.09±3.08pA/pF，P＜0.05)，G(o)6983(1μM)显著抑制了木犀草素引起的Kir电流增大(P＜0.05)。
结论：
1.在-140~-60mV范围内，木犀草素浓度依赖性地(30~100μM)增大Ba2+敏感的RCASMCKir电流，并使I-V曲线下移(负值增大)。
2.PKC抑制剂G(o)69831μM可显著抑制木犀草素(100μM)引起的Kir电流增大。提示木犀草素引起Kir电流增大可能与PKC通路有关。