雨生红球藻的光保护机制及脂肪酸与虾青素合成的相互关系

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虾青素是一种重要的类胡萝卜素,具有良好的着色功能、超强的抗氧化功能及抗肿瘤作用,在水产养殖、食品添加剂、医药保健品等方面有着广泛的应用前景。单细胞雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)在胁迫条件下能够积累大量的虾青素(约为细胞干重的4%)和中性脂肪酸(约为细胞干重的25%)。因此,雨生红球藻被认为是天然虾青素最好的来源。  雨生红球藻除了是虾青素等次级类胡萝卜素的最好天然来源外还是一种很有前景的生物柴油来源。生长迅速的雨生红球藻运动细胞常被用作在各种胁迫条件下生产虾青素和TAG的工作细胞。然而,由于运动细胞对胁迫环境比较敏感,诱导初期细胞死亡率高,使细胞生物量和目标产物产量普遍较低,导致相关产品价格高昂。  本研究首先采用HPLC-ESI-MS/MS方法建立了一种简便快捷的脂肪组学分析方法分析雨生红球藻的甘油酯组成。该方法可以分析微藻中大部分甘油酯(MGDG、DGDG、SQDG、PG、PC、PE、PI、DGTS和TAG)的进行定性和定量分析。  其次,本研究考察雨生红球藻细胞在低光成熟及高光诱导过程中的细胞形态、色素成分、光合作用效率和甘油酯组成等的特征和变化。研究发现雨生红球藻的成熟静止细胞比运动细胞具有更强的应对高光胁迫环境的能力。成熟静止细胞拥有多种细胞保护机制,包括启动NPQ(Non-photochemical quenching)、用循环电子流传递取代线性电子流传递、降低叶绿体膜脂的同时积累大量的TAG。与运动细胞相比,成熟静止细胞能更有效地减少光反应线性电子传递链,同时提高PSⅠ上的循环电子传递链用以处理细胞吸收的过量光能。另一方面,高光胁迫后运动细胞中的PSⅡ的核心蛋白-D1蛋白,以及许多与叶绿体膜相关的甘油糖脂都有了显著地下降,这表明运动细胞内的光氧化压力比成熟静止细胞大。综上,本文该部分研究结果表明以成熟静止细胞为工作细胞将是降低雨生红球藻诱导初期细胞死亡率、提高藻细胞生物量和相关生物产品产量的有效方法。此外,本研究利用本文建立的脂肪组学分析方法首次阐明了雨生红球藻在细胞成熟和高光适应过程中,细胞甘油糖脂组成的变化。  雨生红球藻中超过95%的虾青素是以单酯或双酯的形式存在。有报道称雨生红球藻中虾青素合成和脂肪酸合成存在很强的相互关系。本文通过在雨生红球藻培养基中分别添加脂肪酸合成抑制剂和类胡萝卜素合成抑制剂,证实了当抑制虾青素或脂肪酸合成路径时,另一条合成路径也受到影响。在此基础上,分别考察了类胡萝卜素合成抑制剂和脂肪酸合成抑制剂对虾青素和脂肪酸合成关键基因的影响。类胡萝卜素合成抑制剂的添加刺激了虾青素合成关键基因——八氢番茄红素合成酶(psy)和类胡萝卜素羟化酶(crtR-b)——的表达,但是对脂肪酸合成的关键基因——硬脂酸ACP脱氢酶(sad)和生物素羧化酶(bc)——却没有太大的影响。类似的,脂肪酸合成抑制剂的添加对虾青素合成关键基因的表达也没有太大的影响。该结果表明这两条合成路径的相互关系并不是作用在基因表达水平的。  在脂肪酸合成受抑制的雨生红球藻中加入不同外源脂肪酸,结果发现虾青素的合成可以得到恢复,并且绝大部分的虾青素都以虾青素酯的形式存在。该结果表明虾青素与脂肪酸两条合成路径的相互影响是作用在代谢产物水平的,并且虾青素的酯化反应是两条代谢路径联系的关键。虾青素体外合成实验进一步表明虾青素的酯化过程可以缓解游离虾青素对虾青素合成过程的反馈抑制。通过对雨生红球藻亚细胞器合成虾青素效率的考察,本研究发现以β-胡萝卜素为底物合成游离虾青素以及虾青素酯的合成都发生在内质网上。此外,本研究还发现甘油酰基转移酶(Diacyglycerol acyltransferase,DGAT)很可能参与虾青素的酯化反应。综合本文研究所得,本研究在此前的基础上对雨生红球藻中虾青素的合成模型进行补充,提出了“内质网-油滴”模型。
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