CpG ODN是一类以CpG为核心的具有免疫激活功能的寡核苷酸序列。它能直接或间接激活B细胞、树突状细胞、巨噬细胞、抗原提呈细胞、T细胞、NK细胞的活化或增殖,诱导以Th1型为主的免疫应答,是一种高效低毒的免疫激活剂。但人工合成的CpG ODN成本高、产量低,不适用于大规模生产,限制了CpG免疫刺激剂在水产养殖中的普遍应用。利用ODNs的核酸分子特征,插入质粒载体,通过工程菌株的自身繁殖大量扩增免疫刺激序列将有效解决成本昂贵,生产率低的问题,有助于新型水产抗病药物的研制开发。 实验的第一章,我们选择对鱼虾类有较佳免疫活性的CpG ODNs,相互串联并人工合成,利用同尾酶切技术将串联序列五次重复克隆于pYES2载体中,构建成含多拷贝CpG基序(90个拷贝)的质粒载体pYES2-90CpG。 实验的第二章,分别以鲫鱼(Carassius auratus),鲈鱼(Lateolabrax japonicus)两种重要经济养殖鱼类为实验材料,评价携带多拷贝CpG基序的质粒DNA在鱼类中的免疫活性,尤其是非特异性免疫刺激和调节作用。结果显示:pYES2-90CpG能体外诱导鲫鱼、鲈鱼头肾的巨噬细胞活化,引发呼吸爆发作用和杀菌活性;直接促进外周血淋巴细胞的增殖,免疫刺激效应均明显高于空质粒产生的作用。另外,鲫鱼经pYES2-90CpG注射后48h,体内诱导头肾细胞Mx蛋白(一种Ⅰ型IFN诱生蛋白)的表达,刺激天然杀伤细胞增强因子(NKEF)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和MHCⅡβ等免疫相关分子基因表达量的增加。这些发现提示,CpG DNA可以作为进一步理解鱼类是如何抵抗病原细菌侵染的重要工具。 实验的第三章,pYES2-90CpG腹腔注射南美白对虾(Litopenaeus vannamei)12h后,以空质粒为阴性对照,使血清的酚氧化酶(PO)和溶菌酶(LSZ)活力显著提高,血清抗菌力水平增强。说明CpG ODNs串联序列能有效激活养殖对虾的非特异免疫力。 由此可见,含多拷贝CpG基序的质粒pYES2-90CpG有效增强水产动物细胞和体液介导的免疫应答,有望成为高活性、低成本的广谱型CpG免疫增强剂,用于提高鱼虾等养殖水产类的免疫水平,在减少水产类病害和增强鱼用疫苗的免疫效力方面有着广泛的应用前景。