论文部分内容阅读
大量资料表明,内源性硫化氢（Hydrogen sulfide,H2S）是继一氧化氮和一氧化碳之后的第三种气体信号分子,广泛参与了多种生理和病理过程。在心血管系统,H2S主要是由胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine-γ-lyase,CSE）催化生成。研究发现,内源性CSE/H2S体系缺陷促进动脉粥样硬化（Atherosclerosis,As）发生发展,上调内源性CSE/H2S体系则抑制As病变形成。血管内皮细胞功能失调是As发生的始动环节,H2S对于内皮细胞功能的保护是其拮抗As主要机制之一。目前,CSE/H2S体系已成为As干预的一个重要环节,探讨CSE/H2S体系的调控机制,寻找调控这一体系的潜在靶标,对于保护血管内皮细胞功能,抑制As进展具有重要意义。DNA去甲基化酶10-11位转位蛋白2（Ten-Eleven-Translocation protein 2,TET2）可以把5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine,5-mC）转化为5-羟甲基化胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine,5-hmC）,在DNA去甲基化中扮演重要角色。有报道发现人As斑块中TET2和5-hmC表达水平明显低于正常血管,而且As斑块中TET2的表达量与As的严重程度呈负相关,但TET2在As的发生发展中的具体作用及其机制目前尚不清楚。有文献提示,在As的病理生理过程中TET2与CSE/H2S体系可能具有相关性,我们的生物信息学预分析结果提示cse启动子具有发生dna甲基化修饰的潜在可能性。因此,本研究提出如下科研假说:“tet2通过上调内源性cse/h2s体系而改善血管内皮细胞功能失调拮抗as”。为证实这一科研假说,本研究将首先构建tet2过表达和tet2低表达的小鼠as模型,在整体水平观察tet2对cse/h2s体系调控作用及对as病变形成的影响;然后,在体外细胞实验,进一步阐明tet2通过调控cse/h2s体系改善血管内皮细胞功能失调的作用及分子机制。本项目的完成,有望从dna去甲基化这个新视点揭示内源性cse/h2s体系的调控机制,并进一步揭示tet2在as发病中的作用,为as的防治提供新的药物作用靶点和干预途径。第一部分tet2对apoe-/-小鼠血管cse/h2s体系及动脉粥样硬化病变的影响目的:探索tet2过表达或低表达对apoe-/-小鼠血管cse/h2s体系以及as病变的影响。方法:构建tet2过表达慢病毒载体（lv-tet2）和tet2干扰慢病毒载体（lv-tet2shrna）,分别感染apoe-/-小鼠,并高脂喂养,建立tet2过表达和tet2低表达的小鼠as模型。喂养12周时处死动物,分别采用免疫组织荧光法、westernblotting、dotblot检测小鼠主动脉tet2、5-hmc表达情况;全自动生化分析仪检测各组小鼠血脂水平;改良的亚甲基蓝法检测血浆中h2s含量;苏丹Ⅳ染色检测主动脉粥样硬化病变面积;油红o染色、masson染色检测主动脉窦as斑块脂质蓄积的情况;免疫组织荧光法检测as斑块巨噬细胞浸润情况和内皮完整性;免疫组织荧光法、荧光定量pcr或westernblotting分别检测主动脉cse、icam-1、vcam-1以及nf-κbp65的表达情况。结果:构建的lv-tet2和lv-tet2shrna分别使apoe-/-小鼠主动脉tet2、5-hmc过表达和低表达;对照组、lv-tet2组和lv-tet2shrna组三组小鼠血脂水平、体重无明显差异;与对照组相比,lv-tet2组小鼠血浆中h2s含量增加,主动脉csemrna和蛋白质的表达上调,同时该组小鼠as病变面积明显减少、as斑块中脂质蓄积和巨噬细胞浸润减少,并且小鼠as斑块表面内皮较完整,主动脉中icam-1、vcam-1、nf-κbp65表达下调,而lv-tet2shrna组小鼠各项检测指标的变化与lv-tet2组正好相反,且差异具有显著性。小结:（1）tet2过表达可上调apoe-/-小鼠主动脉cse/h2s体系,tet2低表达则下调apoe-/-小鼠主动脉cse/h2s体系;（2）tet2过表达可降低apoe-/-小鼠主动脉nf-κbp65以及icam-1、vcam-1的表达,减少血管内皮功能损伤,减轻小鼠as病变程度,tet2低表达则作用相反。第二部分tet2调控cse/h2s体系抑制ox-ldl诱导的内皮细胞功能失调的作用及机制研究目的:以ox-ldl处理的huvecs为实验模型,观察细胞内tet2表达情况以及cse/h2s体系的变化,并从去甲基化修饰的角度进一步探讨tet2通过调控cse/h2s体系改善ox-ldl诱导huvecs功能失调的作用及分子机制。方法:1.不同浓度ox-ldl处理huvecs不同时间,实时定量pcr和westernblotting检测细胞tet2、csemrna和蛋白质的表达,滤膜吸附亚甲基蓝法、h2s特异性荧光探针法分别检测细胞h2s生成率和h2s水平。2.以tet2过表达质粒、tet2干扰质粒、tet2过表达质粒+csesirna和/或ox-ldl处理huvecs细胞,滤膜吸附亚甲基蓝法、h2s特异性荧光探针分别检测各组细胞内h2s生成率和h2s水平,观察huvecs细胞与人单核细胞thp-1的黏附情况,实时定量pcr和/或westernblotting检测细胞cse、icam-1、vcam-1、nf-κbp65表达以及ikbα的降解,并用免疫荧光检测细胞nf-κbp65核转位的情况。3.生物信息学分析cse基因启动子区域cpg岛情况,以tet2过表达质粒、tet2干扰质粒和/或ox-ldl处理huvecs细胞,bsp测序法定量检测cse基因启动子cpg岛的甲基化状态。结果:1.实时定量pcr和westernblotting结果显示,ox-ldl呈浓度和时间依赖性下调huvecs中tet2、csemrna和蛋白质表达,降低细胞h2s生成率和h2s水平。2.tet2过表达可上调ox-ldl处理的huvecs细胞csemrna和蛋白质表达,增加细胞h2s生成率和h2s水平,tet2低表达的效应与高表达的相反;与ox-ldl单独处理组相比,tet2过表达组细胞与人单核细胞thp-1黏附的数目减少,细胞icam-1、vcam-1mrna和蛋白质表达降低,并且ikbα降解和nf-κb核转位均减少,tet2低表达组细胞情况则与tet2过表达组细胞相反,而加入csesirna抑制cse/h2s体系后,tet2过表达改善huvec细胞功能失调的作用被逆转。3.生物信息学分析结果显示,cse基因启动子区域具有cpg岛,且各分析指标明显优于cpg岛的标准定义;bsp分析结果显示,ox-ldl单独处理组cse基因启动子CpG岛甲基化频率为56.8%,明显高于对照组细胞的1.6%,而TET2过表达组和TET2干扰组细胞CSE基因启动子CpG岛甲基化频率则分别为4%、77.6%,与ox-LDL单独处理组相比差异均有显著性。小结:（1）ox-LDL处理的HUVECs中CSE/H2S体系下调,这与细胞中TET2表达变化趋势一致;（2）TET2过表达可下调ox-LDL处理HUVEC细胞ICAM-1和VCAM-1的表达,减少其与人单核细胞THP-1的黏附,改善HUVEC细胞功能失调;（3）TET2改善ox-LDL诱导内皮细胞功能失调的作用是通过上调CSE/H2S体系、抑制NF-κB活化这一途径来实现的;（4）TET2可通过对CSE基因启动子CpG岛去甲基化,抑制ox-LDL引起的CSE基因异常高甲基化,从而上调其表达。