论文部分内容阅读
目的:观察凝血酶激活的血小板对人外周血CD4+T细胞向Tfh分化的影响。方法:1 CD4+T细胞的提取、纯度验证及激活抽取健康青年男性外周血(n=5),梯度密度离心法提取外周血单个核细胞(PBMC);将提取的PBMC用免疫磁珠方法分选出CD4+T细胞;流式细胞术鉴定CD4+T细胞分离纯度;CD3/CD28联合抗体激活分选出的CD4+T细胞;流式细胞术检测激活后CD4+T细胞CD69表达。2血小板的提取及激活抽取健康青年男性外周血(n=5),二次离心法提取血小板;凝血酶(0.2U/ml,37℃,5min)激活提取的血小板;流式细胞术检测激活后血小板CD62P表达。3血小板与CD4+T细胞共培养分别将激活的CD4+T细胞按照如下分组进行培养:A血小板组:激活血小板+CD4+T细胞;B上清组:激活的血小板上清液+CD4+T细胞;C对照组:单纯培养基+CD4+T细胞。4观察CD4+T细胞形态变化;共培养72h后收集培养基,ELISA法检测IL-10表达。分别以CD4、PD-1、CXCR5、Fox P3流式抗体标记共培养后的CD4+T细胞,检测各组中Tfh(CD4+PD-1+CXCR5+Foxp3-)占CD4+T细胞比例。结果:1 CD4+T细胞磁珠分选纯度鉴定及激活状态检测:流式细胞术验证磁珠分选CD4+T细胞纯度为(95.93±2.14)%。流式细胞术检测CD4+T细胞激活后CD69表达情况,激活组(13.05±2.12)%,明显高于未激活组(1.48±0.25)%,有统计学差异(P<0.01)。2血小板激活状态检测:凝血酶(0.2U/ml,37℃,5min)激活血小板后,血小板表面CD62P阳性表达情况为凝血酶组(46.27±2.58)%明显高于未激活组(10.29±0.44),有统计学差异(P<0.05)。3激活后的血小板同激活后的CD4+T细胞共培养后,镜下观察,与上清组及对照组相比,血小板组CD4+T细胞表现出明显的细胞聚集性。4 ELISA法检测共培养72h后培养基中IL-10的含量,其中血小板组IL-10含量为(60.77±7.59)pg/ml,明显高于上清组(14.08±2.78)pg/ml及对照组(11.24±2.81)pg/ml,有统计学差异(P<0.05);而上清组与对照组无统计学差异。5流式细胞术检测CD4+T细胞CD4、PD-1、CXCR5、Fox P3表达情况,其中血小板组Tfh占CD4+T细胞比例为(10.75±2.46)%,明显高于上清液组(6.10±3.09)%及对照组(3.00±1.76)%,有统计学差异(P<0.05)。而上清组与对照组无统计学差异。结论:1激活后的血小板可以促进CD4+T细胞聚集。2激活后的血小板可以促进CD4+T细胞IL-10的分泌。3激活后的血小板可以促进人外周血CD4+T细胞向Tfh分化。