谷氨酰胺酶在食管鳞癌发生发展中的作用及其机制的初步研究

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背景与目的食管癌在全球恶性肿瘤中发病率和死亡率均较高。根据组织学类型可分为食管鳞状细胞癌(ESCC)和食管腺癌(EAC)。在我国主要以食管鳞癌为主,在食管鳞癌的发病机制中,肿瘤细胞的能量代谢异常也是其中的重要因素之一。谷氨酰胺(glutamine,Gln)是人细胞较丰富的一种非必需氨基酸,参与生物大分子合成及能量代谢。Gln不仅参与正常细胞的生长代谢,对肿瘤细胞的生长也发挥着重要作用,为肿瘤细胞的增殖提供必要的能量物质。另外,Gln参与癌细胞的氧化还原反应以维持细胞的活性,而谷氨酰胺代谢少不了相关酶的催化反应,谷氨酰胺酶(glutaminase,GLS1)是谷氨酰胺代谢途径中的限速酶,抑制GLS1的表达,从而能够有效的抑制癌细胞的增殖甚至杀死癌细胞。谷氨酰胺能量代谢在很多肿瘤细胞中发挥重要作用,但它是如何调控食管鳞癌的发生发展以及发挥什么样的作用尚未知晓,因此,阐明GLS1在食管鳞癌中的作用及其机制对预防和治疗食管鳞癌具有重要的科学价值和临床意义。本实验通过分析食管鳞癌组织及癌旁组织中GLS1的表达状况以及与临床参数之间的关系;并观察下调GLS1对食管鳞癌细胞生物学行为的影响以及对Wnt信号通路中β-catenin/p-GSK-3β/c-myc关键蛋白表达的影响,从而来探讨GLS1对食管鳞癌发生发展的影响及其机制,为GLS1作为治疗靶点提供理论基础。方法1.用免疫组化法检测70例食管鳞癌组织和44例癌旁组织中GLS1蛋白表达水平并分析与临床参数之间的关系。2.用谷氨酰胺缺乏实验检测6种分化程度不同的食管鳞癌细胞对谷氨酰胺的依赖性,以正常食管上皮细胞HET-1A为对照,筛选出对谷氨酰胺依赖性较强的细胞。3.Western blot检测分化程度不同的6种食管鳞癌细胞中GLS1蛋白表达,以HET-1A为对照,筛选出GLS1表达较高的细胞。4.克隆形成实验检测谷氨酰胺缺乏时细胞的生长情况;siRNA转染用Western blot检测两种细胞GLS1蛋白的表达;用分光光度计检测两种细胞中谷氨酰胺酶的活性变化。5.CCK-8实验检测细胞增殖情况;划痕和transwell实验观察细胞迁移侵袭能力;流式细胞术法检测细胞周期和凋亡6.流式细胞术法检测细胞中ROS的变化。7.Western blot检测细胞Wnt信号通路中β-catenin/p-GSK-3β/c-myc关键蛋白的表达变化。结果1.GLS1在食管鳞癌组织中的表达及与临床参数之间的关系食管鳞癌组织中GLS1蛋白在细胞浆中表达较多,细胞膜和细胞核有少量表达;与癌旁组织相比,食管鳞癌组织中GLS1阳性率较高(p<0.05);GLS1蛋白表达量与食管鳞癌患者的临床的病理分级相关。2.谷氨酰胺缺乏实验结果谷氨酰胺的缺乏对HET-1A和食管鳞癌细胞EC109、EC9706影响很小,食管鳞癌细胞EC-1、TE-1的生长增殖虽然受到了抑制,但对谷氨酰胺敏感度不强;而在1、3、5、7天中食管鳞癌TE13和KYSE70细胞对谷氨酰胺敏感度较高,说明TE13和KYSE70细胞对谷氨酰胺有较强的依赖性。3.Western blot检测6种食管鳞癌细胞中GLS1蛋白表达以HET-1A为对照,食管鳞癌细胞系EC-1、EC109、EC9706中GLS1的蛋白表达低(p>0.05);TE-1虽然表达量高,但在谷氨酰胺缺乏实验中表现出对谷氨酰胺敏感度不强;而食管鳞癌细胞TE13,KYSE70中GLS1蛋白高表达(p<0.01)且对谷氨酰胺敏感性较强。4.谷氨酰胺缺乏的克隆形成实验以含Gln的培养基为对照,TE13和KYSE70细胞在含有Gln培养基中生长较好且能够聚集成细胞集群,但在缺少Gln培养基中,细胞集群形成受到了显著的抑制,细胞克隆形成数目减少(p<0.05)。5.下调GLS1对TE13和KYSE70细胞谷氨酰胺酶的活性影响以siNC为对照,siGLS1#1和siGLS1#2转染后食管鳞癌TE13,KYSE70细胞中GLS1的活性明显下降。6.下调GLS1对TE13和KYSE70细胞增殖的影响以siNC为对照,siGLS1#1和siGLS1#2转染后24h、48h、72h的细胞存活率明显下降,可见下调GLS1可以降低食管鳞癌细胞的增殖能力。7.下调GLS1对TE13和KYSE70细胞迁移和侵袭能力的影响1)迁移能力实验:以siNC为对照,siGLS1#1和siGLS1#2转染48h的TE13和KYSE70细胞的迁移率明显下降(p<0.01),说明可见下调GLS1可以降低食管鳞癌细胞的迁移能力。2)侵袭能力实验:以siNC为对照,siGLS1#1和siGLS1#2转染48h的TE13和KYSE70细胞的侵袭能力明显下降(p<0.01),说明可见下调GLS1可以降低食管鳞癌细胞的侵袭能力。8.下调GLS1对TE13和KYSE70细胞周期和凋亡的影响1)以siNC为对照,siGLS1#1和siGLS1#2处理72h后的食管鳞癌细胞的周期在G2/M期的分布增加(p<0.01),说明下调GLS1使食管鳞癌细胞的周期阻滞在G2/M。2)以siNC为对照,siGLS1#1和siGLS1#2处理72h后的食管鳞癌细胞TE13和KYSE70总凋亡率均增加(p<0.05),说明下调GLS1能够诱导食管鳞癌细胞TE13和KYSE70的凋亡。9.下调GLS1对TE13和KYSE70细胞内ROS的影响以siNC为对照,siGLS1#1和siGLS1#2处理72h后细胞中的ROS水平均显著性上升,说明下调GLS1后可以提高细胞内的活性氧。10.下调GLS1对TE13和KYSE70细胞内Wnt信号通路中关键蛋白的影响TE13和KYSE70细胞经转染后β-catenin/p-GSK-3β/c-myc信号通路中β-catenin、p-GSK-3β、c-myc 的蛋白表达水平下降(p<0.05)。结论GLS1在食管鳞癌组织和细胞中呈高表达;下调GLS1能够使食管鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力下降、谷氨酰胺酶的活性降低、细胞周期发生阻滞、细胞凋亡增加;其机制可能与升高ROS水平,抑制Wnt信号通路的关键蛋白有关。
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