【摘 要】
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研究背景和目的叉头框（forkhead box,FOX）基因家族是一个转录因子大家族,其分子结构具有forkheadbox DNA结合区。目前已发现人类FOX家族的50个成员。FOX的许多基因具有重要的生物学功能。在细胞调控、上皮分化、胚胎发育以及器官形成中都有重要作用;FOX家族还通过其转录因子的活性作用,调节其他基因的表达,在肿瘤的形成、生长、分化、增殖、凋亡、迁移、侵袭等过程参与调节。FOX
【基金项目】
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国家自然科学基金资助项目（81672875）； 国家自然科学基金资助项目（81772964）； 国家卫生计生委公益事业专项（201502026）； 广东省科技计划项目（20178020209003）；
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研究背景和目的叉头框（forkhead box,FOX）基因家族是一个转录因子大家族,其分子结构具有forkheadbox DNA结合区。目前已发现人类FOX家族的50个成员。FOX的许多基因具有重要的生物学功能。在细胞调控、上皮分化、胚胎发育以及器官形成中都有重要作用;FOX家族还通过其转录因子的活性作用,调节其他基因的表达,在肿瘤的形成、生长、分化、增殖、凋亡、迁移、侵袭等过程参与调节。FOXK1是FOX转录因子家族的一员,在肿瘤文库,对比相应的正常组织,脑部肿瘤、结肠癌、直肠癌及其转移淋巴组织肿瘤中检测到FOXK1明显升高,提示FOXK1可能在癌症的过程中起到促癌作用,并促进了这些肿瘤的侵袭和转移。我们之前对FOXK1的研究证实,FOXK1对胃癌的侵袭和转移有促进作用。为了进一步了解FOXK1介导的胃癌的侵袭转移机制,我们的团队通过生物信息学预测了调节FOXK1的基因,选取了和EMT有关的Vimentin作为候选的调控基因,作为研究对象。本课题旨在研究FOXK1和Vimentin相互作用,与上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）的关系,并进一步阐明它们在胃癌的进展和转移过程中EMT调节的分子机制,为胃癌可能存在的治疗靶点提供一定的理论基础。研究内容和方法首先,采用实时荧光定量PCR检测胃癌手术标本中FOXK1mRNA的表达情况,利用组织芯片、免疫组化技术对比胃癌组织和癌旁正常组织中FOXK1的表达量;通过质粒稳定转染技术过表达胃癌细胞中的FOXK1,再利用CCK-8实验和soft-agar实验,评价其对胃癌细胞增殖的影响。接着,我们用蛋白质免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）研究FOXK1和Vimentin在胃癌细胞内是否相互结合,并用细胞免疫荧光的方法研究FOXK1和Vimentin在细胞内的分布。再利用经蛋白合成抑制剂环己亚胺（CHX）处理的载体FOXK1转染SCG7901细胞,探讨Vimentin对内源性FOXK1的稳定性的影响,通过以上方法,我们探讨FOXK1对胃癌增殖性的影响以及FOXK1和Vimentin是否相互作用及其稳定性,是否具有协同作用。接下来,我们通过以下实验研究FOXK1和Vimentin在胃癌组织中的表达相关性。1.通过Westernblot检测胃癌新鲜手术标本的FOXK1和Vimentin的表达量,并使用Image J来进行灰度值计算,进一步统计分析。2.利用组织芯片技术和免疫组化染色技术（Immunohistochemistry,IHC）检测胃癌手术标本中两个基因的表达情况并分析它们与患者年龄、性别、肿瘤发生部位、是否淋巴结转移、TNM分期等的相关性,并进行单因素、多因素分析,以及两个基因的表达情况和患者生存情况的关系等。接着通过转染技术人为地过表达胃癌细胞中FOXK1和敲减Vimentin的表达,然后观察细胞表型、罗丹明鬼笔环肽实验及Westernblot检测EMT相关标志物和通路调节蛋白来观察FOXK1-Vimentin轴对胃癌细胞EMT的影响;再利用划痕实验（wound healing实验）和细胞侵袭实验（Transwell实验）得出的结果进行统计学分析,评估FOXK1对胃癌细胞生物学特性的影响。最后,通过体外细胞实验及构建裸鼠转移瘤模型进一步验证FOXK1-Vimentin轴促进EMT介导的体内胃癌迁移和侵袭,并采取IHC及qPCR等手段进一步阐述。结果1.FOXK1在胃癌组织及胃癌细胞中的表达高于正常组织,过表达FOXK1可以对胃癌细胞的增殖起促进作用。2.FOXK1和Vimentin在胃癌细胞内共定位有交集,FOXK1的N-末端参与了与Vimentin的蛋白质相互作用,他们相互之间稳定作用,并具有协同效应。3.FOXK1和Vimentin在胃癌组织中表达上调,其表达水平与肿瘤分化程度、年龄、浆膜浸润、淋巴结转移有关,共表达的病例预后最差。4.FOXK1和Vimentin在胃癌组织中表达均上调并呈正相关,在胃癌细胞中过表达FOXK1可以抑制E-cadherin的表达,促进Vimentin、Snail、MMP2和MMP9的表达,敲减Vimentin后可以促进E-cadherin的表达,抑制上述其余蛋白的表达;FOXK1上调后,EMT通路信号蛋白ERK1/2、APT、mTOR的磷酸化形式随之上调,抑制Vimentin后均随着FOXK1的下调而表达减少。5.体外功能实验中,过表达FOXK1可以促进胃癌细胞EMT,敲减了Vimentin后可以逆转EMT的过程。6.体内实验中,FOXK1可以促进裸鼠胃癌肺转移,敲减Vimentin则可抑制其作用。结论FOXK1在胃癌组织中表达上调,并有促进胃癌细胞增殖、侵袭、转移的作用,Vimentin在胃癌细胞内与FOXK1具有稳定的协同作用,敲减Vimentin可以抑制FOXK1介导的胃癌细胞EMT过程,进而抑制胃癌的侵袭转移活性。
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