菌剂的分离与鉴定及其控制柑橘黄龙病病原效果的探讨

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柑橘黄龙病是危害柑橘产业严重病害之一,至今还没有有效的防治手段。本研究采用菌剂灌根方式对感染了黄龙病的日南一号(Citrus.unshiu Marc.‘Nichinan NO.l’)盆栽苗进行处理,对菌剂处理前后的样品进行检测,观察病原的变化情况,研究菌剂生物防控柑橘黄龙病的机制,为提高柑橘无病毒苗木良种繁育效率提供辅助。并对有效的2号菌剂进行分离得到纯化的单菌株,通过形态观察、生理生化指标检测、序列比对等方法对分离得到的单菌株进行鉴定。1.对菌剂处理(前十次处理浓度为1.0g/L、1.5L/株,之后10~23次增加为1.67g/L、1.5L/株)和清水处理的日南一号分别在处理的第20、23次时,采用实时荧光定量PCR和常规PCR对叶脉进行黄龙病病原浓度检测。结果显示:经过2号菌剂处理20次,日南一号的阳性检出率从最开始的100%下降到66.7%,继续处理到23次,日南一号的阳性检出率仅有16.67%。经过6号菌剂处理20次,日南一号的阳性检出率从最开始的100%下降到50%,继续处理到23次,日南一号的阳性检出率为0%。菌剂处理能有效的降低黄龙病病原浓度。2.对2号、6号菌剂处理和清水处理23次后日南一号的株高、冠径、距地10 cm干粗等生长指标和叶绿素含量、光合速率、可溶性糖含量,淀粉含量等生理指标进行检测,结果显示:2号、6号菌剂能促进植株生长发育,2号、6号菌剂处理能减少可溶性糖含量、淀粉含量;2号、6号菌剂处理有利于叶绿素积累。而经2号、6号菌剂处理的样品叶片光合作用与对照相比,无显著差异。3.对菌剂处理和清水处理的日南一号的多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、超氧化物歧化酶(SOD)、硫氧还原蛋白氧化还原酶(TrxR)5种与抗性相关酶的活性进行了测定。结果显示:经2号、6号菌剂处理的日南一号五种酶活性在菌剂处理后的0 h-36 h与对照相比均有显著的升高。4.对菌剂处理和清水处理的日南一号的PAR1、NHO1、HSP90、STG1四种抗性相关基因通过相对定量的方法进行表达量的分析。结果显示:经2号、6号菌剂处理的日南一号四种抗性基因表达量在菌剂处理后的0 h-36 h与对照相比均有显著的升高。5.对有效的2号菌剂进行分离得到2-1、2-2两种单菌株,将分离得到的2-1、2-2通过菌的表型特征观察、生理生化鉴定初步将两菌株归入芽孢杆菌一类。再接着对菌株进行基于16S rDNA、recA、recN 3对基因进行序列比对。结果显示:16S rDNA的测序结果再一次证明了2-1、2-2菌株为芽孢杆菌一类。2-1的recA、recN序列比对结果与贝莱斯芽孢杆菌LD02相似度为99%、100%,因此2-1菌株可能为贝莱斯芽孢杆菌。2-2的recA、recN序列比对结果与解淀粉芽孢杆菌WS-8相似度均为100%,因此推测2-2菌株可能为解淀粉芽孢杆菌。
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