棉花双隐性核不育系ms5ms6的不育性稳定且不育表型明显常常被应用于杂交棉的制种,因此ms5ms6的败育机制一直为人们所关注。前人研究表明,ms5ms6的败育过程中淀粉、可溶性糖、脂类等多种因子发生变化。但其败育的主导原因仍未被解析。为了解析ms5ms6的败育机制,我们收集了ms5ms6单位点纯合材料黄冈29S不育系,结合ms5ms6的RNA-seq数据和代谢物质的测定以达到初步解析ms5ms6基因导致棉花雄性败育的分子机制。主要得到以下结果:1.ms5ms6可育株与不育株花药表型观察以及发育时期划分对ms5ms6可育株与不育株花药进行观察,发现随着花药发育,不育株的花药逐渐干瘪皱缩,且集中于花柱底部,柱头不外露,开花后不育株花药表面无花粉,TTC染色结果也表明不育株未形成成熟花粉粒。ms5ms6可育株石蜡切片结果显示,ms5ms6可育株的花蕾长度从3-4mm、4-5mm、5-6mm、6-7mm、7-8mm、8-9mm、9-14mm、14-24mm、>24mm分别对应花药的stage4到stage12,与前期实验室报道结果相一致。2.陆地棉ms5ms6不育株绒毡层和花粉壁发育异常对ms5ms6不育株与可育株花药切片结果进行比较分析,发现不育株花药在stage7时绒毡层已开始降解,在stage8时期小孢子明显皱缩畸形,小孢子外壁无刺突形成（扫描电镜同样证明此结果）;随后小孢子出现破裂,细胞核外漏,开始有降解,逐渐形成有花粉壁包裹的空腔,当花药发育成熟时,药室最终只残留花粉降解后成分。透射电镜结果表明,ms5ms6不育株stage7的胼胝质壁结构正常,小孢子出现皱缩,在stage8败育表型更为明显,即花粉壁外壁缺失,内壁电子密度异常,花粉孔增多。因此stage7时不育株中绒毡层的降解是导致雄性不育的主要原因。3.ms5ms6不育株淀粉和可溶性糖代谢紊乱对stage7和stage8花药进行糖类的测定,发现在stage7时不育株淀粉积累量较低,但stage8时含量高于可育株。PAS淀粉染色结果与淀粉测定结果基本一致,且淀粉染色差异存在于绒毡层中。可溶性糖测定结果显示,在stage7时可育株和不育株可溶性糖差异不明显,但在stage8时可育株中可溶性糖、葡萄糖、蔗糖、果糖含量显著高于不育株。因此,推测不育株中绒毡层提前降解可能与淀粉的积累量有关,而花粉壁外壁的缺失与可溶性糖代谢的紊乱可能存在联系。4.ms5ms6不育株花药中脂类、脂肪酸代谢被扰乱依据表型分析结果,选取ms5ms6两系stage6,stage7,stage8,stage9四个发育时期的花药进行转录组测序。结果显示四个花药时期共得到13101个差异基因,其中208个基因在四个时期中存在表达差异。对四个时期差异基因进行GO分析,发现四个时期中差异基因在“代谢过程”、“细胞过程”、“有机物代谢过程”富集。其中“代谢过程”富集度最高。通过进一步对stage6和stage7“代谢过程”的差异基因分析,发现“脂肪酸代谢”生物学过程只存在于绒毡层提前降解时期（stage7）,进而测定这四个时期花药中游离脂肪酸含量,发现不同游离脂肪酸的变化具有时期特异性。其中C16:0和C18:1在四个时期中都存在显著差异,且在stage7时期差异尤为明显。5.差异基因的筛选及表达谱的验证我们从四个时期共有的208个差异基因以及A12和D12染色体差异基因之中筛选出13个差异基因用于表达谱验证。q RT-PCR结果显示,选取差异基因的变化趋势与表达谱中变化趋势基本一致,随后利用SPSS进行相关系数计算,得到四个时期的总相关系数为0.698,该结果表明q RT-PCR结果与RNA-seq结果相符度较高。6.ms5ms6败育调控机制探讨筛选基因Ghi#S2417是拟南芥中绒毡层发育和花粉壁形成关键基因MS1的同源序列。在stage7-stage8时相较于可育株,不育株中MS1表达量上调,脂质代谢相关基因Ghi#S2539和Ghi#S2536的表达量也出现了上调,而孢粉素合成基因Ghi#S0325和Ghi#S0121表达量下调。因此,推测在不育株花药败育过程中,ms5ms6使MS1在stage7时表达量上调,造成绒毡层发育调控网络的紊乱,提前启动了绒毡层的降解过程。同时MS1可能对花粉壁发育具有负反馈调节作用,MS1表达量的上调导致下游基因Ghi#S0325和Ghi#S0121表达量下降,同时影响脂质代谢基因Ghi#S2539和Ghi#S2536正常表达,导致花药脂代谢异常,抑制了孢粉素合成,进而引起花粉壁外壁缺失,产生雄性不育。