碱性蛋白酶菌株的筛选及酶学性质表征

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碱性蛋白酶是指在中性至碱性pH范围内具有肽键水解活性的蛋白酶。随着人们环保意识的提高,工业生产中倡导使用环境友好型工艺流程,这为碱性蛋白酶在工业生物技术上的推广使用提供了一个良好的机会。碱性蛋白酶广泛存在于动植物和微生物中,由于动植物资源有限,筛选可产碱性蛋白酶的微生物成为了生物酶的资源开发热点。本研究从海南近海贝类养殖基地采取淤泥样品,从中分离筛选出一株产碱性蛋白酶的菌株F3,以此为研究对象,对其进行菌种鉴定、发酵产酶条件优化;对其所产碱性蛋白酶进行质谱鉴定、酶学性质研究;探索了此酶添加到洗涤剂中对蛋白质污渍的去除效果,为碱性蛋白酶在洗涤工业应用提供理论支持。研究结果如下:(1)利用酪素平板法初筛,Folin-酚法测酶活复筛,获得了一株产碱性蛋白酶活力较高的菌株F3。经过形态学鉴定、分子生物学鉴定,确定其为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)。通过细胞毒性实验、叶片侵染实验以及小鼠急毒实验证明菌株F3对巨噬细胞、植物(木薯、水稻、花生、薯蓣)叶片以及小鼠均无毒性。(2)通过单因素试验和Plackett-Burman实验,确定了pH、半乳糖和Na Cl这三个因素对产酶影响显著。通过最陡爬坡实验确定了响应面实验设计的中心点,最终通过响应面分析确定了菌株F3的最佳发酵产酶条件:半乳糖11.09 g/L、初始pH 8.4、蛋白胨20 g/L、Na Cl 5.04 g/L、接种量0.01 OD600、K2HPO410 g/L、装液量为150 m L/500m L、温度30℃、培养时间为48 h。优化后菌株F3产碱性蛋白酶活力为339.36±4.3U/m L,较优化前提高了2.21倍。(3)通过发酵液离心、50%饱和度硫酸铵沉淀、透析、阴离子交换层析四步分离纯化流程,成功得到了分子量约50 KDa碱性蛋白酶。探究了其酶学性质,其最佳催化温度为40~50℃,最适pH为9,具有良好的热稳定性和耐碱性;5 m M和10 m M的Mg2+、Ca2+、Co2+显著促进了酶活,而Fe2+、Li+对酶活有明显抑制作用;1%(v/v)H2O2和SDS对酶活影响不显著,该酶对Tween-80、Triton-X100不耐受,而Tween-20对该酶有促进作用;此酶对大多数有机溶剂均不耐受,只有20%、30%(v/v)正己烷对酶活有一定促进作用。(4)通过洗涤性能测试,证明了向汰渍洗衣粉溶液添加该酶,可以有效改善对棉织物上的血液污渍和蛋黄液污渍的去除效果。通过SEM、EDS和FTIR技术证明了酶处理前后不会对棉织物的表面形貌、化学元素组成和结构产生影响。
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