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γ-微管蛋白基因是自然界最保守的基因之一,其编码蛋白是微管组织中心(microtubulin organization center,MTOC)的重要组成成分。人们最早在动物上的研究表明,γ-微管蛋白作为动物中心体的一种重要成分,在微管的成核、细胞周期调控以及有丝分裂纺锤体的形成等方面起非常重要的作用。由于植物细胞中没有中心体的结构,它在植物细胞中的功能一直没有非常明确的答案,这也成为近年来很多植物细胞生物学家关心的热点问题。鉴于γ-tubulin基因是一种非常重要的保守基因,它的断裂可引起生物致死,因此应用传统方法研究其功能很困难。最近国内外学者利用负向遗传学的手段进行了大量的研究,Pavla和Martine分别利用诱导型的RNA干涉的方法及通过筛选得到γ-tubulin基因的突变体的方法研究了该基因对拟南芥植株生长发育的影响,发现γ-tubulin低表达可影响到叶片的生长、根的发育及气孔的排布等。本研究组也利用PVX诱导的γ-tubulin基因沉默的方法,首次得到了γ-tubulin基因低表达的烟草植株,发现该基因的低表达对植株的生长发育有明显的影响,如叶片形状变窄、长宽比明显增大、叶片部分区域出现明显的皱褶或卷曲,在生殖生长阶段甚至出现全部花苞脱落等特殊表型。本研究首先以烟草(N.tobacum var.Samsun NN)无菌苗为材料,通过农杆菌介导的转基因技术,将携带有部分正反串连的γ-tubulin基因片段的载体转化到烟草无菌苗中,利用得到的γ-tubulin基因低表达的烟草转化体的表型来进一步分析该基因对植物生长发育的影响。结果表明,γ-tubulin低表达对植株的生长发育产生了明显的影响:有80%左右的植株出现了多个生长点;而且叶片形态出现异常,有大量的联体叶或筒状叶出现;另外植株根的形态也发生改变,主要表现为主根不发达而侧根呈强势生长的“鱼刺状”。对植株生长素IAA的分析测定发现,γ-tubulin低表达植株其内源生长素IAA含量明显高于对照空载植株,通过进一步对其极性运输输出载体基因P-glycoproteins(PGP1)的表达分析发现,PGP1在γ-tubulin低表达植株上部的表达量明显低于对照空载植株。因此推测,γ-tubulin低表达对植株生长发育的影响可能与生长素合成异常及其极性运输受到抑制有关,从而最终使植物生长发育产生异常。另外,本研究还分析了含有γ-tubulin部分插入片段(从319核苷酸至841核苷酸的522 bp的编码区片段)的重组PVX载体(PVX:as Gam D)侵染的烟草植株的花药发育情况。研究发现,当植株花苞发育到一定时期时,出现所有花苞陆续脱落的现象。利用Real time PCR检测花苞基部γ-tubulin的表达,发现被PVX:as_Gam_D侵染的烟草中γ-tubulin mRNA水平明显降低,这表明在这些植株中发生了γ-tubulin的基因沉默。应用石蜡切片法分别对对照植株(PVX空载体侵染的植株)花苞和γ-tubulin基因沉默的植株花苞进行观察,结果表明:野生型烟草中小孢子发生和雄配子体发育过程正常,有雄蕊5枚,雄蕊原基经过一系列分化后发育形成4个小孢子囊,造孢细胞进一步分化形成排列紧密的小孢子母细胞,小孢子母细胞经减数分裂最终形成四分体;经正对照PVX空载体侵染的烟草,其小孢子发生和雄配子体发育过程无异常;γ-tubulin基因沉默的烟草小孢子发生和雄配子体发育出现明显的异常现象:有的花苞在造孢细胞时期发育正常,随着小孢子进一步发育到小孢子母细胞时期时出现了异常,发生早脱;有的花苞在四分体时期绒毡层细胞和小孢子发生了畸变导致脱落;同时在此过程中还观察到胚珠发育也表现异常。因此γ-tubulin基因沉默严重影响了烟草小孢子发生及雄配子体发育。