论文部分内容阅读
猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type2，PCV2)属于圆环病毒科。主要编码ORF1和ORF2两大阅读框。ORF1编码与病毒复制相关的Rep蛋白，ORF2构成PCV2免疫相关的结构蛋白Cap。其中，Rep基因形成Rep和Rep’蛋白，两者对病毒DNA的复制均是必须的。本研究检测了PCV2上存在ORF3和ORF4蛋白，初步分析了它们的功能。
以纯化的重组ORF3、ORF4原核蛋白为免疫原，按常规方法免疫BLAB/c小鼠制备单克隆抗体。取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，对杂交瘤细胞进行筛选，最终各获得4株和6株持续稳定分泌ORF3(1H3，3B1，3D12和3G7)和ORF4(2D3，1G12，2B8，4A4，4H4和6C6)单克隆抗体的杂交瘤细胞株。抗体亚型鉴定表明，所有抗体的重链和轻链均分别为IgG，κ。以纯化的原核蛋白免疫新西兰兔，制备的抗ORF3和ORF4血清的琼扩效价均达到1：64以上。ORF3、ORF4单克隆抗体和多克隆抗体均能分别与PK—15细胞上表达的ORF3、ORF4蛋白发生特异性反应。
当PCV2病毒粒子感染PK—15细胞后，应用RT—PCR和Northern blot技术分别能检测到ORF3和ORF4编码的mRNA在PK—15细胞上的转录。应用制备抗ORF3豚鼠血清和抗ORF4兔血清能分别在PCV2感染的PK—15细胞内检测到ORF3和ORF4蛋白的存在，ORF3和ORF4蛋白主要表达在细胞核。这些数据分别从RNA和蛋白水平上分别证明ORF3、ORF4基因在PCV2上的存在。
将构建的PCV2感染性克隆(pSK—PCV2)、ORF3(pSK—PCV2—m3)和ORF4(pSK—PCV2—m4)基因分别缺失的感染性克隆转染PK—15细胞，48 h后用抗PCV2的ORF2蛋白单克隆抗体(单抗1C7)、ORF3豚鼠多克隆抗体和ORF4兔多克隆抗体进行免疫组织化学检测，完整PCV2分子克隆均能产生ORF2、ORF3和ORF4蛋白， ORF3缺失的感染性克隆仅能检测到ORF2、ORF4蛋白，ORF4缺失的感染性克隆仅能检测到ORF2、ORF3蛋白。拯救的病毒抗原在PK—15细胞上连续传至第8代，ORF3缺陷型病毒从第一代的103.33TCID50/ml逐步增长至P8代的107.5TCID50/ml；ORF4缺陷型病毒从第一代的103.5TCID50/ml逐步增长至P8代的106.5 TCID50/ml。完整的PCV2感染性克隆病毒从P1代的103.5 TCID50/ml逐步增长至P8代的108 TCID50/ml。对传代的拯救病毒进行核苷酸序列测定，未发现核苷酸的回复突变，说明ORF3和ORF4基因对病毒的复制是非必需的。