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紫金牛科紫金牛属(Ardisia),全株及根供药用,为我国民间常用的中草药,也是常见的花卉。其中大叶紫金牛(Ardisia gigantifolia Stapf)的根或者全株,是瑶医的常用药材,以根叶或全株入药,可治跌打损伤、风湿筋骨疼痛、产后瘀血、痈疽溃疡、痛经等症,对小儿麻痹后遗症、半身不遂有良效;矮茎紫金牛为紫金牛科植物腺点紫金牛Ardisa punctalindl(亦称山血丹,金边罗伞、九管血)的根茎,药理研究表明具有止咳平喘、抗炎抑菌、抗肿瘤、驱虫杀菌等作用。本论文主要研究了紫金牛属植物中化学成分的抗肿瘤、抗氧化活性,并对紫金牛属植物化学成分中间苯二酚衍生物的抗肿瘤作用机制进行了体外分子药理学和体内基础药理学的较深入研究,为发现更多新的活性成分,阐明紫金牛属植物的抗肿瘤药效物质基础提供了理论和实验依据。
应用MTT 法对从大叶紫金牛和矮茎紫金牛中分离鉴定得到的18个单体化合物进行体外抗肿瘤活性筛选,通过DPPH 法测定其抗氧化活性;通过Hoechst 33258荧光染色法,caspase 酶活力测定法,免疫印迹western blotting 法,对从矮茎紫金牛中分离鉴定的单体化合物AB-E-2-3-1进行体外引起肿瘤细胞凋亡的分子机制研究;并通过荷瘤裸鼠抑瘤率实验,对单体化合物AB-E-2-3-1进行体内抑瘤实验的初步研究。MTT 易被水溶解和透过细胞膜,可被活细胞内的琥珀酸脱氢酶还原,形成不溶于水的蓝紫色的甲瓒结晶。结晶物形成的量与细胞数量及代谢活性成比例,活细胞越多,与MTT 形成的甲瓒结晶越多,蓝紫色越深,吸光度(A)值越大,因此吸光度(A)值的大小可反映活细胞的数量;DPPH是一种稳定的有机自由基,其溶液具有特征的紫红色团吸收峰,当存在自由基清除剂时,由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失,其褪色程度与其所接受的电子数成定量的关系,因而可用分光法进行定量分析;Hoechst 33258是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料,对细胞的毒性较低。Hoechst 33258 染色常用于细胞凋亡检测,染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测,也常用于普通的细胞核染色,或常规的DNA 染色,在荧光显微镜下观察或封片后荧光显微镜下观察。细胞发生凋亡时,会看到凋亡细胞的细胞核呈致密浓染,或呈碎块状致密浓染;Caspase (Cysteine-requiring AspartateProtease)是一个在细胞凋亡过程中起重要作用的蛋白酶家族。Caspase-3 也称Yama、apopain 或 CPP32,有时被写作caspase3 或caspase-3,属于caspase家族的CED-3亚家族(CED-3 subfamily),是细胞凋亡过程中的一个很关键的酶。Caspase-3 可以剪切procaspase 3、6、7和9,并可以直接特异性剪切许多caspase 底物,包括PARP(poly(ADP-ribose)polymerase),ICAD(Inhibitor of caspase-activated deoxyribo-nuclease),gelsolin和fodrin等。Caspase-3是哺乳动物细胞中研究最多的一个caspase。这些由caspase-3 介导的蛋白剪切是细胞凋亡分子机制的重要组成部分。另外,caspase-3在细胞核凋亡过程中也起到了关键作用,包括染色质固缩(chromatincondensention),凋亡小体形成(The formation of apoptotic bodies),DNA 片段化(DNAfragmentation)等。同时caspase-3对细胞起泡(Cell blebbing)也起到关键作用;免疫印迹western blotting 法是利用抗原抗体的免疫反应,先将蛋白通过SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶)电泳分离开来,然后再利用电场力的作用将胶上的蛋白转移到固相载体(NC 硝酸纤维素膜或PVDF 膜)上,也就是转膜,然后再加一抗和二抗之后,形成抗原抗体复合物,利用ECL Plus 发光试剂或其它的显色原理将结果显示到膜或底片上。
从大叶紫金牛中分离鉴定的单体化合物LHZ-5、LHZ-6、LHZ-9对6种肿瘤细胞的增殖表现明显的抑制活性;LHZ-7、LHZ-8 除了对人胃癌细胞SGC-7901增殖抑制活性较弱之外,对其他肿瘤细胞的增殖抑制活性均较好;LHZ-1、LHZ-2、LHZ-3、LHZ-4、WZ-1无明显的抗肿瘤活性。从矮茎紫金牛中分离鉴定的单体化合物AB-E-2-3-1对人肺癌A549,人胰腺癌PANC-1,人肝癌SMMC-7721等多种肿瘤细胞增殖均表现显著的抑制活性。DPPH 自由基清除活性测试结果表明,大叶紫金牛和矮茎紫金牛中分离所得单体化合物均无明显的抗氧化活性。
实验结果可知,LHZ-5、LHZ-6、AB-E-2-3-1对多种肿瘤细胞的增殖均表现明显的抑制作用;Hoechst 33258 荧光染色实验,caspase-3和caspase-9 酶活力水平检测实验,免疫印迹western blotting 实验表明从矮茎紫金牛中分离鉴定的单体化合物AB-E-2-3-1可诱导人胰腺癌PANC-1细胞发生凋亡;裸鼠荷瘤实验模型的建立以及紫金牛属植物中化学成分活性间苯二酚衍生物AB-E-2-3-1体内抑瘤实验表明,AB-E-2-3-1与阳性对照药物环磷酰胺CTX和NF-B 抑制剂BAY 相比,对人肺癌A549细胞在裸鼠体内的增长有较好的抑制作用。