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在动物机体磷代谢生理活动中,动物肠道吸收、肾脏重吸收和骨骼沉积构成磷代谢的核心环节,小肠的吸收是磷进入体内代谢的第一步,也是体内磷代谢的关键步骤,在磷的平衡中起到核心作用。而维生素D3及其衍生物在转化为最终活性产物1,25-二羟基维生素D3(1,25-(OH)2-D3)与肠道维生素D受体(VDR)结合后,可以通过基因和非基因途径调节动物体内磷的代谢。1,25-(OH)2-D3与VDR结合后,通过基因途径调节钙磷吸收的途径尚未明确。因此,本试验旨在探究维生素D通过基因途径影响肉鸡小肠钙磷吸收主要信号通路,为研究肉鸡肠道磷吸收的分子机制提供理论基础。试验一、基于转录组测序RNA-seq分析维生素D调节肉鸡十二指肠钙和磷吸收的差异表达基因和信号通路本试验利用转录组测序技术(RNA-seq)筛选维生素D调节肉鸡小肠磷吸收的功能基因和信号通路。以1～16日龄罗斯308肉鸡为试验动物。设计三种饲粮,分别在基础饲粮(不含维生素D)中添加不同水平1,25-(OH)2-D3(0、5、10 μg/kg)。16日龄时屠宰肉鸡,刮取十二指肠粘膜,利用转录组学技术,对差异表达基因进行GO(Gene Ontology)功能注释和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信号通路富集。结果显示:(1)与基础饲粮组相比,添加5和10μg/kg 1,25-(OH)2-D3显著改善肉鸡生长性能,增强股骨和胫骨矿化(P<0.05);但10 μg/kg1,25-(OH)2-D3组肉鸡胫骨与股骨的重量、长度和灰分重量低于5μg/kg 1,25-(OH)2-D3组(P<0.05)。(2)测序经数量控制后,9个样品共得到61.96Gb的有效数据(clean reads),每个样品平均产出6.88Gb的有效数据(clean reads),将测序获得的数据与鸡参考基因组进行比对,与参考基因组的比对率为89.98%～91.08%,与参考基因集的比对率为78.61%～81.44%,满足后续要求。(3)本试验测序共检测到肉鸡十二指肠表达的基因数有18173个,其中已知基因17557个,预测新基因616个;(4)分别进行0vs 5、0 vs 10、5 vs 10 μg/kg 1,25-(OH)2-D3三对处理间的比较,在各对处理间筛选出1029、939和642个差异表达基因。(5)经 GO 功能注释,筛选出 VDR(nVDR)、PDIA3(mVDR)、SLC34A2(NaPi-Ⅱb)、SLC20A1(PiT-1)、SLC20A2(PiT-2)、CALB1(CaBP-D28k)、ATP2B1(PMCA1b)、ATP2B2、SLC8A1(NCX1)、FGF1和FGF19等差异表达基因,这些基因富集到十二指肠中调节钙和磷吸收代谢的过程。(6)KEGG通路富集结果显示:调节钙吸收的差异表达基因富集到环磷酸鸟苷-蛋白激酶G(cGMP-PKG)信号通路、环磷酸腺苷(cAMP)信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路;调节磷吸收的差异表达基因富集到MAPK信号通路、酪氨酸激酶-转录激活因子(Jak-STAT)信号通路和磷脂酰肌醇-3-激酶-丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(P13K-Akt)信号通路。(7)选出4个差异表达基因进行实时定量PCR检测,显示,qRT-PCR结果与转录组测序RNA-seq结果基本一致。试验结果表明:MAPK信号通路可能参与1,25-(OH)2-D3调控肉鸡十二指肠磷吸收的过程。试验二、维生素D调控肉鸡十二指肠中NaPi-Ⅱb磷转运蛋白表达的信号通路研究本试验旨在探究维生素D调控肉鸡十二指肠中钠依赖Ⅱb型磷转运蛋白(NaPi-Ⅱb)表达的信号通路。将90只1日龄罗斯308肉鸡分为9个处理,每个处理10个重复,每重复1只。试验时间1-14日龄。试验采用3×3因子设计,考察3种饲粮(不含维生素D的基础饲粮、VD3 500 IU/kg饲粮、25-OH-D3 500 IU/kg饲粮)和腹腔注射3种注射液(生理盐水、p38 MAPK抑制剂SB203580、ERK1/2 MAPK抑制剂PD98059)对肉鸡十二指肠磷吸收相关基因表达的影响。肉鸡11-14日龄时进行腹腔注射,持续4天,注射剂量为1 mg/kg体重,注射时间为每天下午两点,注射频率为1次/天。饲喂粉状配合饲料,自由采食和饮水。结果显示:(1)与基础饲粮(不含维生素D)相比,肉鸡饲喂含500 IU/kg VD3或25-OH-D3饲粮显著提高肉鸡股骨和胫骨的重量、长度、灰分重量、灰分含量、钙含量与磷含量(P<0.05),对股骨和胫骨直径无显著影响(P>0.05)。(2)以注射生理盐水为对照组,注射p38MAPK抑制剂和ERK1/2抑制剂后对肉鸡生长性能和骨骼发育没有显著影响(P>0.05)。(3)与基础饲粮(不含维生素D)相比,饲喂500 IU/kg VD3或25-OH-D3饲粮显著提高肉鸡十二指肠NaPi-Ⅱb mRNA和蛋白表达水平(P<0.05),nVDR和mVDR mRNA的表达量也相应提高,但与对照组相比差异不显著;饲喂500 IU/kg VD3或25-OH-D3饲粮显著降低了 p38MAPK在Thr180位点的磷酸化水平(P<0.05)和ERK1/2在Thr204位点的磷酸化水平(P<0.05),对p38MAPK和ERK1/2基因mRNA表达无显著影响(P>0.05);(4)以注射生理盐水为对照组,腹腔注射ERK1/2抑制剂或p38MAPK抑制剂显著提高肉鸡十二指肠细胞核维生素D受体(nVDR)、NaPi-Ⅱb mRNA 和蛋白表达水平(P<0.05),显著降低了 p38MAPK 在 Thr180位点的磷酸化水平(P<0.05)和ERK1/2在Thr204位点的磷酸化水平(P<0.05),对p38MAPK和ERK1/2基因mRNA表达无显著影响(P>0.05)。数据表明,p38MAPK和ERK1/2抑制剂上调nVDR、NaPi-Ⅱb mRNA和蛋白表达,说明MAPK信号通路参与维生素D调节肉鸡十二指肠磷主动吸收的过程。综上所述,VDR(nVDR)、PDIA3(mVDR)、SLC34A2(NaPi-Ⅱb)、SLC20A1(PiT-1)、SLC20A2(PiT-2)、FGF1和FGF19等基因可能通过MAPK信号通路参与维生素D调节肉鸡小肠磷吸收代谢的过程,1,25-(OH)2-D3与VDR结合后可能通过MAPK/p38和MAPK/ERK1/2信号通路调节NaPi-Ⅱb表达水平,从而调节肉鸡肠道磷吸收。