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苜蓿(Medicago sativa L.)是世界上最重要的牧草作物之一,而苜蓿病毒病害的发生给苜蓿生产带来了严重损失。明确苜蓿病毒种类、筛选抗病品种对苜蓿病毒病的防治具有重要意义。第二代测序技术突破了传统的病毒检测方法无法检测未知病毒的局限性,目前已成为病毒检测鉴定的前沿技术之一。本研究通过对30个苜蓿品种的病毒病发病情况进行田间调查,利用多指标综合比较各苜蓿品种的抗性,以期为进一步开展苜蓿品种种质资源的评价和利用提供科学依据;利用小RNA深度测序技术检测了河南地区30个苜蓿品种中的病毒病的种类,通过contigs拼接和比对在30个苜蓿品种中均检测出了苜蓿花叶病毒(Alfalfa mosaic virus,AMV);并对AMV来源的小RNA进行深度分析,进一步探讨苜蓿在抵抗AMV入侵时的分子机制。本研究分为三个试验:试验一:30个苜蓿品种对病毒病的田间抗性初步研究。结果表明:(1)所有苜蓿品种的田间发病率均超过94%,病情指数范围为31.53～55.50;(2)30个苜蓿品种中,抗性较强的品种有1个,抗性一般的品种有6个,其余23个品种的抗性较差,分别占供试品种的3.33%,20.00%和76.67%;(3)聚类分析结果表明,抗性较强的射手2号与其他苜蓿品种的亲缘关系较远。试验二:小RNA深度测序鉴定苜蓿花叶病毒。试验结果表明:(1)通过Velvet软件将利用深度测序技术得到的小RNA序列进行组装拼接,拼接的序列总长为7217 nt,占AMV全长(共8274 nt)的87.23%。(2)根据AMV来源的si RNA、定位在AMV基因组上的contigs以及对应的参考基因组序列设计引物。对AMV进行PCR扩增,割胶回收和克隆测序。共扩增到5344 bp的片段,与AMV基因组的同源性高达96%;其中,与AMV的外壳蛋白基因组份的同源性为99%。(3)利用MEGA软件对AMV外壳蛋白基因组构建系统进化树发现,本研究扩增得到的AMV分离物与AMV韩国分离物的亲缘关系较近,与AMV伊朗分离物的亲缘关系较远。试验三:苜蓿花叶病毒来源的小RNA的深度分析。结果表明:(1)AMV三个基因组来源的si RNA的极性分布差异较大,来自AMV三个基因组正义链的si RNA数量均高于来自负义链的si RNA数量;(2)AMV三个基因组来源的si RNA的长度分布几乎一致,其中长度为21 nt和22 nt的si RNA占主要部分;(3)AMV三个基因组来源的si RNA的5’碱基偏好性有所不同,其中,以“U”或“C”开头的AMV来源的si RNA要比以“A”或“G”开头的多,并且,在AMV来源的不同长度的si RNA中也遵循这样的规律;(4)AMV三个基因组来源的si RNA的热点分布区域差异较大,AMV-RNA1来源的si RNA的热点区域主要集中在AMV-RNA1基因组600～800位置;AMV-RNA2来源的si RNA的热点区域主要集中在AMV-RNA2基因组1190～1370位置;AMV-RNA3来源的si RNA的热点区域主要集中在AMV-RNA3基因组1241～1580位置。