基于DNA自组装纳米结构的生物传感新方法研究

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“液体活检”是恶性肿瘤患者早期无创诊断的重要技术手段,目前已成为分子诊断和生物分析化学领域的研究热点。循环肿瘤DNA(Circulating tumor DNA,ctDNA)作为“液体活检”的主要靶物质之一,含有丰富且稳定的生物学信息,在疾病诊断、治疗和预后评估中具有重要价值。然而,现阶段的检测技术无法适应在不同环境条件下诊断的需要,限制了其在临床上的广泛应用。与此同时,纳米技术和材料科学的进步带动了体外诊断技术的迅猛发展,众多新型纳米材料已在医学与健康领域得到成功应用,为更深入的探索打下了基础;此外,生物传感技术在分析检测领域的拓展也为适应不同需求的生物信息获取带来了新的动力。因此,针对目前“液体活检”存在的部分问题,本研究整合多学科、多技术平台,将DNA纳米组装技术、材料科学技术与表面等离子体共振(Surface plasmon resonance,SPR)及荧光共振能力转移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)生物传感技术相结合,构建了一系列灵敏、特异、无酶的核酸检测新方法。本研究的实施将有助于拓展分子检测领域的研究思路,并为丰富“液体活检”技术方法学提供更多理论和实践依据。1基于改良非线性杂交链反应的融合基因SPR分析方法建立非线性杂交链(Hybridization chain reaction,HCR)反应是通过两个双链DNA二聚体和辅助链的持续置换反应形成树枝状DNA纳米结构,基于该结构的较大分子质量能显著增强表面等离子体共振(SPR)的信号。因此,本研究在简化反应序列和实验步骤基础上,利用改良非线性HCR反应,仅使用三条单链核酸序列绑定和循环杂交,在SPR界面进行高效的自组装,形成“探针-靶物质-DNA树枝”的夹心结构,构建了用于急性早幼粒细胞白血病融合基因PML/RARα亚型的快速检测SPR方法。该方法不仅获得了良好分析性能(最低检测限:“L”亚型:0.72 pM;“S”亚型:0.65 pM),而且实现了简单、高效的分析过程,并对PML/RARα不同亚型的临床样本PCR产物进行了成功鉴定。由于SPR传感方法的实时、无酶、无标记优势更适用于不同环境条件下的检测需求,因此该研究为融合基因的即时检测和相关临床疾病的快速诊断提供了一个新的潜在应用平台。2基于适配体功能化DNA水凝胶的融合基因SPR分析方法建立基于模块结构的DNA自组装是形成多维超分子纳米结构的重要形式。适配体功能化的DNA水凝胶不仅自身具有良好的序列空间排布和较大的分子质量,而且可通过其功能基团封装更多大分子物质形成超分子聚合物。因此,本研究首先基于四条核酸链设计并制备了两种含链霉亲和素(SA)适配体的DNA自组装X单体聚合物作为基元,而后进一步在SPR界面组装X1和X2形成DNA网状水凝胶结构,最后通过适配体封装SA,实现了SPR信号的显著增强。该方法用于PML/RARα“S”亚型的检测,获得了100 fM到10 nM的线性范围,最低检测限为45.22 fM靶物质,这突破了之前基于自组装SPR方法线性范围下限在pM水平的限制。同时,该方法将对PML/RARα亚型临床样本PCR产物的分析性能提高了一个数量级。因此,本研究对进一步探索基于SPR的界面自组装规律提供了新的经验,对建构更优越分析性能的传感方法提供了新的思路。3基于磁性复合探针解锁茎环结构的融合基因荧光分析方法建立长链循环肿瘤核酸中的二级结构对特定位点基因片段的杂交检测具有潜在的阻碍。因此,对长链核酸分析方法的探索需要选择地改变核酸构象和输出特异性信号。本研究首先基于Link DNA和“Y”型DNA探针在磁性纳米颗粒表面的杂交,构建对PML/RARαDNA“L”亚型具有捕获、茎环结构解锁和富集的多功能磁性复合探针(Magnetic composite probe,MCP)。然后,利用MCP驱动的连锁反应,结合MoS2@FAM荧光探针快速信号输出的生物传感策略,用于100个碱基PML/RARαDNA“L”亚型检测。该方法在无任何信号放大的工作程序下,分析线性范围为1 pM到200 nM,最低检测限达到0.223 pM。此外,该方法成功地应用于血清样品中靶物质的检测,这为进一步研究将其应用于直接杂交定量检测更长链循环肿瘤核酸基因片段提供了基础。
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