第一部分M i croRNA-200a靶向调控Rheb在十二指肠空肠旁路术后胰岛素抵抗改善中的作用研究背景近年来,糖尿病(diabetes mellitus,DM)的发病率在以中国和印度为代表的全球各个国家均呈上升趋势,全球已有4.15亿成年糖尿病患者,其中中国糖尿病患者约1.14亿。糖尿病最主要的特点是慢性血糖水平升高,其中2型糖尿病(T2DM,Type2 diabetes mellitus)占总糖尿病患者约90%。糖尿病患者总数和糖尿病防治相关开支之巨大使得糖尿病成为一个非常严肃且亟待控制的公共卫生问题。目前全球成人糖尿病患者约4.15亿,且约6730亿美元被用于相关的防治工作中;按照糖尿病患者的增长速度,到2040年全球约有6.42亿的成人糖尿病。2型糖尿病的传统治疗的方法俗称"五驾马车",包括糖尿病教育、运动治疗、饮食治疗、药物治疗和自我血糖监测在内的五大基本治疗原则。减重手术(Bariatric surgery)的设计初衷是为病态肥胖的患者减轻体重,但长期研究积累的大量证据提示,减重手术可以有效缓解2型糖尿病,更迅速稳定地达到预期治疗效果。减重手术已被国际糖尿病联盟(IDF)、美国糖尿病协会(ADA)及中华医学会糖尿病学分会列为2型糖尿病的一项治疗措施。十二指肠空肠旁路术(Duodenal-jejunal bypass,DJB)缓解T2DM的具体作用机制不明晰。肝脏,作为机体糖代谢的重要器官,对糖的贮存分解和血糖的调节发挥着尤为关键的作用。肝脏胰岛素信号通路基础活性,是肝脏调控葡萄糖代谢动态平衡的关键,而Rheb作为胰岛素通路的重要调控分子发挥着重要的作用。MicroRNAs(miRNAs)是一组非编码、内源性、具有特定功能性的小RNA片段,在基因转录后的信使RNA水平调控基因的表达。已有很多文献报道,miRNAs在包括T2DM、肿瘤等很多疾病中发挥着重要作用,肝脏组织中miRNA的异常表达也会影响肝脏调控葡萄糖代谢动态平衡,因此作为一种敏感的标记物,miRNA的检测对于T2DM病情的评估和治疗方案的选择都将会有重要的意义。研究目的本研究采用2型糖尿病大鼠实施十二指肠空肠旁路术,研究以下问题:(1)DJB术后肝脏miRNA表达谱是如何变化的;(2)DJB是否调节Rheb介导的肝脏胰岛素通路活性;(3)miR-200a是否可直接与Rheb的mRNA结合导致其降解从而影响其蛋白水平表达;(4)miR-200a是否能诱导胰岛素抵抗大鼠肝细胞系下调Rheb表达水平,从而上调IRS1介导的肝脏胰岛素通路活性;(5)编码miR-200a慢病毒转染DJB术后大鼠是否会引起糖尿病复发。研究方法本研究中,我们以高脂联合STZ诱导建立2型糖尿病Wistar大鼠模型,接受DJB术后的大鼠检测随机血糖、体重、能量摄入、胰岛素耐量试验和口服葡萄糖耐量试验,术后2周、4周、8周分别处死大鼠取大鼠肝脏组织对胰岛素通路各关键分子进行Western免疫印迹和免疫组化检测,大鼠肝脏组织利用高通量miRNA表达分析阵列得出DJB术后大鼠肝脏miRNA表达谱变化,利用大鼠肝脏细胞系和脂质体转染siRNA技术研究miR-200a对于胰岛素抵抗大鼠肝脏细胞中胰岛素通路的影响,利用慢病毒表达系统实施转染研究miR-200a对于DJB术后大鼠肝脏胰岛素敏感性的研究。研究结果1.DJB术后第5周起DJB组随机血糖低于SHAM组大鼠(P<0.05),且从第5周起随机血糖差别逐渐增大。DJB术后四周时,DJB组与SHAM组大鼠OGTT各时间点血糖明显降低(P<0.05),DJB组与SHAM组大鼠OGTT各时间点胰高血糖素样肽-1(Glucagon-likepeptide-1,GLP-1)明显升高(P<0.05),OGTT 各时间点胰岛素无差别(P>0.05),DJB组大鼠ITT各时间点血糖低于SHAM组(P<0.05)。2.利用高通量miRNA表达分析阵列技术比较DJB组与SHAM组大鼠肝脏组织microRNA表达量,发现包括miR-200a在内的12种microRNA明显表达差异。根据microRNA靶点预测软件分析,Rheb可能是miR-200a的潜在调控靶点。大鼠经过4周高脂饮食后肝脏miR-200a表达量较对照组下降30%,链脲霉素腹腔注射后3天肝脏miR-200a表达量较对照组下降45%,T2DM大鼠DJB术后2周、术后4周分别检测肝脏miR-200a表达量发现较假手术组T2DM大鼠肝脏miR-200a表达量分别升高 50%、70%(P<0.05)。3.DJB术后胰岛素抵抗的改善由Rheb介导。T2DM大鼠接受DJB术后8周肝脏Rheb/mTOR蛋白水平表达较假手术组T2DM大鼠肝脏明显下调,酪氨酸磷酸化的胰岛素受体底物1(IRS1)和胰岛素受体底物2(IRS2)、丝氨酸磷酸化的蛋白激酶B(AKT)蛋白在大鼠肝脏表达量DJB组高于假手术组,T2DM大鼠肝脏组织丝氨酸磷酸化的IRS2蛋白含量在DJB术后未发生改变。T2DM大鼠DJB术后8周肝脏组织切片IHC染色结果再次证实Rheb表达量较假手术组降低。磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)和葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)在DJB术后较假手术组明显降低(P<0.05)。4.miR-200a能靶向调节Rheb蛋白水平。miR-200a过表达能引起Rheb的mRNA水平降低65%、蛋白水平降低33%,miR-200a低表达则能引起Rheb的mRNA水平升高50%、蛋白水平升高33%。荧光素酶报告基因实验发现miR-200a能靶向结合Rheb启动子区顺式作用元件从而抑制Rheb表达。5.miR-200a能下调Rheb下游分子从而上调IRS1依赖的胰岛素传导通路。蛋白质印迹法(Western Blot)显示胰岛素抵抗的BRL细胞系在过表达miR-200a时磷酸化mTOR水平低于对照组,从而引起酪氨酸磷酸化IRS1/2和丝氨酸磷酸化AKT明显高于对照组。相反,低表达的miR-200a能引起高水平的磷酸化mTOR从而在蛋白水平抑制酪氨酸磷酸化IRS1/2和丝氨酸磷酸化AKT。胰岛素抵抗的BRL细胞系在过表达或低表达miR-200a时并未影响丝氨酸磷酸化IRS2蛋白水平。6.DJB术后肝脏miR-200a抑制Rheb表达并引起了一系列糖代谢的变化。编码miR-200a抑制物的慢病毒注射后,大鼠肝脏miR-200a表达量相比对照组降低90%。OGTT实验发现注射编码miR-200a抑制物的慢病毒的DJB术后糖尿病大鼠在经口灌注葡萄糖后的所有时间点(30分钟、1小时、2小时)的血糖水平均高于注射慢病毒空白载体的DJB术后糖尿病大鼠。胰岛素耐量试验显示注射编码miR-200a抑制物的慢病毒的DJB术后糖尿病大鼠在注射胰岛素后葡萄糖清除率明显低于注射慢病毒空白载体的DJB术后糖尿病大鼠。7.DJB+miR-200a抑制物组大鼠肝脏Rheb/mTOR表达量上调,酪氨酸磷酸化IRS1/2和丝氨酸磷酸化AKT水平下降,丝氨酸磷酸化IRS2表达并未改变。免疫组化也证实DJB+miR-200a抑制物组大鼠肝脏Rehb表达量高于DJB+空白慢病毒载体组大鼠。同时DJB+miR-200a抑制物组大鼠肝脏PEPCK和G6Pase表达量明显高于DJB+空白慢病毒载体组大鼠。8.注射编码miR-200a模拟物慢病毒的糖尿病大鼠在OGTT和ITT实验中各个时间点血糖水平均低于注射慢病毒空白载体的糖尿病大鼠,注射编码miR-200a模拟物慢病毒的糖尿病大鼠肝脏Rheb/mTOR下调,其下游的酪氨酸磷酸化IRS1/2及丝氨酸磷酸化AKT表达上调,丝氨酸磷酸化IRS2表达量未发生改变。免疫组化染色证实注射编码miR-200a模拟物慢病毒的糖尿病大鼠肝脏Rheb表达量明显低于注射慢病毒空白载体的糖尿病大鼠。注射编码miR-200a模拟物慢病毒的糖尿病大鼠肝脏糖异生关键酶PEPCK和G6Pase表达量也明显下调。9.qPCR分析得出袖状胃切除术术后肝脏miR-200a表达量相比于假手术组无明显差异,然而DJB术后肝脏miR-200a表达量均高于袖状胃切除术组和假手术组大鼠。结论及意义1.DJB术后肝脏miR-200a表达增多抑制Rheb表达,从而激活胰岛素通路活性,介导了胰岛素抵抗的改善。2.DJB术后的糖尿病大鼠胰岛素敏感性得到改善,但经慢病毒介导的人为的抑制肝脏miR-200a的表达可引起糖尿病的复发。3.外源性过表达肝脏miR-200a可使糖尿病大鼠胰岛素敏感性得到改善,糖尿病得到缓解。第二部分MicroRNA-320靶向调控adipoR1介导十二指肠空肠旁路术后2型糖尿病的改善研究背景2型糖尿病(T2DM)是一种世界范围内十分常见的疾病,根据国际糖尿病联合会统计,全球约7%的人口患有2型糖尿病。高水平餐后血糖和空腹血糖是糖尿病的主要症状,这可以导致多器官多脏器的损害。包括十二指肠空肠旁路(DJB)在内的多种减肥手术能十分有效的治疗2型糖尿病。越来越多的证据提示,循环系统中脂联素的缺乏或者肝脏脂联素信号通路受损均能很大程度的影响肝脏葡糖异生,而糖异生能保证机体的血糖水平处于正常水平,所以脂联素信号通路受损在T2DM的发生和发展中均可能发挥的极为重要的作用。脂联素是一种具有抗糖尿病作用的脂肪因子,主要由脂肪组织表达。研究发现,糖尿病、肥胖和代谢综合征患者的血清脂联素水平均显著降低。脂联素受体AdipoR1和AdipoR2是一组能够拮抗代谢综合征的一组关键膜蛋白,脂联素完成其生物学效应需要与其受体AdipoR1和AdipoR2结合。microRNA(miRNA)是内源性非编码小的长度约为19至22个核苷酸的短链RNA。miRNA由于能够靶向调控基因的转录,故而能在2型糖尿病的发生和发展过程中发挥关键作用。本研究的目的是阐明miRNA通过调节AdipoR1介导的脂联素信号通路在DJB缓解2型糖尿病这个过程中发挥的重要作用。研究目的本课题主要研究以下问题:(1)DJB术后肝脏miRNA表达谱是如何变化的;(2)DJB是否调节adipoR1介导的肝脏脂联素通路活性;(3)miR-320是否可直接与adipoR1的mRNA结合导致其降解从而影响其蛋白水平表达;(4)miR-320是否能诱导大鼠肝细胞系下调adipoR1表达水平,从而下调肝脏脂联素通路活性;(5)编码miR-320慢病毒转染DJB术后大鼠是否会影响手术效果。研究方法本研究中,我们使用HFD/STZ联合的方法建立T2DM大鼠模型,将所有实验大鼠分为2组,每组5只,实施DJB术后的大鼠检测随机血糖、体重、能量摄入、胰岛素耐量试验及口服葡萄糖耐量试验,术后2周、4周、8周分别处死大鼠取大鼠肝脏组织对胰岛素通路各关键分子进行Western免疫印迹和免疫组化检测,大鼠肝脏组织利用高通量miRNA表达分析阵列得出DJB术后大鼠肝脏miRNA表达谱变化,利用大鼠肝脏细胞系和脂质体转染siRNA技术研究miR-320对于肝脏细胞中脂联素通路的影响,利用慢病毒表达系统实施转染研究miR-320对于DJB术后大鼠肝脏脂联素敏感性的研究。研究结果1.术后第8周,DJB组大鼠术后随机血糖水平最低(6.42±1.35mmol/L),且DJB组大鼠和假手术组大鼠之间的随机血糖差异从术后第4周至术后第8周越来越明显。为了验证DJB手术是否能治疗2型糖尿病和胰岛素抵抗,我们于术后的第2周和第4周进行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)和胰岛素耐量试验(ITT)。术后2周,我们比较了在口服葡萄糖耐量试验、胰岛素耐量试验、血清胰岛素水平、血清胰高血糖素样肽-1(GLP-1)水平、稳态模型评估的胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、Matsuda-DeFronzo胰岛素敏感性指数(CISI),但并未发现具有统计学意义的差异。然而术后4周DJB组大鼠在口服葡萄糖耐量试验的各个时间点血糖水平均低于假手术组大鼠。胰岛素耐量试验、稳态模型评估的胰岛素抵抗指数、Matsuda-DeFronzo胰岛素敏感性指数提示术后4周DJB组大鼠已出现胰岛素敏感性的提升。口服葡萄糖耐量试验过程中我们检测了大鼠的血清胰岛素和胰高血糖素样肽-1水平发现,术后4周DJB组和假手术组血清胰岛素水平无明显差异,而DJB组大鼠血清胰高血糖素样肽-1水平稍高于假手术组。2.糖尿病大鼠中DJB组相比假手术组,5个miRNA(miR-503-5p,miR-320-3p,miR-133a-3p,miR-542-3p 和 miR-133b-3p)有明显降低(P<0.05)。这 5 个 miRNA在DJB组大鼠肝脏的表达量相比假手术组降低29-81%。在这5个miRNA中,miR-320-3p下调幅度最大,且miR-320-3p的其中一个预测靶点是adipoR1。在术后进食状态下,DJB组和假手术组大鼠的血清脂联素水平并无统计学差异。在DJB组和假手术组大鼠术后,肝脏的miR-320-3p水平之间出现明显的差异。且这个差异随着术后时间的推移(从术后第二周到第八周)变得愈发明显。3.我们发现在DJB术后2周、4周和8周,AdipoR1在大鼠肝脏的蛋白和mRNA水平表达量明显较假手术组升高,然而AdipoR2肝脏表达量在DJB组和假手术组中并未出现差异。AMPK是AdipoR1下游的关键信号分子,在术后2周、4周和8周这三个时间点,DJB组大鼠肝脏AMPK蛋白水平与假手术组相比明显升高。PPAR-α是AdipoR2在下游的重要信号分子,DJB组与假手术组大鼠相比后,肝脏PPAR-α蛋白水平表达量无统计学差异。相比假手术组大鼠,DJB手术能显著降低糖异生作用相关基因的表达(葡萄糖-6-磷酸酶(G6PC)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶1(PCK1)、过氧化物酶体增殖激活受体γ共激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma co-activator 1 alpha,PPARGC1A)),炎症标志物(C-C模体配体2(CCL2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)),氧化应激标志物如硫代巴比妥酸反应物质(TBARS)和肝脏甘油三酯含量。4.转染miR-320模拟物后miR-320水平增加200倍,然而转染miR-320抑制物后miR-320水平降低70%。在大鼠肝细胞系(Buffalo rat liver cells,BRL)中,过表达miR-320引起AdipoR1在mRNA和蛋白水平减少60%;相反,低表达miR-320引起AdipoR1的mRNA和蛋白水平增加70%和90%。为了确定AdipoR1信使RNA中3’非翻译端中预测靶点是否直接参与miR-320介导的AdipoR1蛋白水平的变化,我们于荧光素酶报告基因下游克隆假定的3’非翻译端中预测靶点,并与miR-320模拟物或抑制物共转染至大鼠肝细胞系中。miR-320模拟物转染后荧光素酶活性与对照组相比降低50%。在miR-320过表达的大鼠肝脏细胞中AMPK磷酸化水平降低,然而miR-320低表达可以引起AMPK磷酸化水平升高。并且,miR-320的低表达可以使arctiin(一种AdipoR1激动剂)刺激后AMPK磷酸化水平升高效果更加显著,然而miR-320过表达未能在胰岛素抵抗大鼠肝脏细胞中形成对AMPK磷酸化水平的影响。5.编码miR-320模拟物的慢病毒注射后7天,大鼠肝脏miR-320表达量较对照组升高4倍。DJB术后四周,两组大鼠的随机血糖较对照组开始出现统计学差异,但体重和摄入能量未出现统计学差异。随后我们进行了 OGTT和ITT实验,测量血清胰岛素和GLP-1水平,并计算了胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)及胰岛素敏感性指数(CISI)。OGTT实验中,注射miR-320模拟物的大鼠在OGTT各个时间点的血样水平均高于对照组大鼠。OGTT实验中,两组大鼠胰岛素水平未出现统计学差异,但注射miR-320模拟物慢病毒的DJB大鼠GLP-1水平更高。ITT试验表明,在最初的30分钟的注射miR-320模拟物慢病毒组DJB大鼠与对照组相比,葡萄糖清除率降低,胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)升高且胰岛素敏感性指数(CISI)降低。注射miR-320模拟物慢病毒组DJB大鼠与对照组相比,大鼠肝脏AdipoR1表达量降低且AMPK信号通路活性降低,从而证实miR-320在体内能够靶向调控adipoR1表达。据文献报道,肝脏AdipoR1-AMPK通路的激活可以降低肝脏糖异生相关基因(如Ppargc1a,Pck1,G6pc)的表达。正如我们预测的,miR-320模拟物慢病毒组DJB大鼠与对照组相比,Ppargc1a、Pck1、G6pc表达量升高。miR-320模拟物慢病毒组DJB大鼠与对照组相比,炎症细胞因子TNF-a和CCL2,氧化应激标志物硫代巴比妥酸反应物质和肝脏甘油三酯升高。6.为了确定肠道的哪一部分在DJB术后引起miR-320表达量变化发挥主要作用,我们检测了 DJB(n = 5)、空肠切除术(n = 5)、回肠切除术(n = 5)和袖状胃切除术(n = 5)术后肝脏miR-320表达量变化。从定量聚合酶链反应数据表明袖状胃切除术(n = 5),回肠切除术(n = 5)和对照组(n = 5)大鼠的肝脏miR-320表达量保持不变,而DJB和空肠切除术组大鼠肝脏miR-320表达量较假手术组相比分别降低60%和40%。结论及意义1.DJB术后肝脏miR-320表达减少,增加adipoR1表达,从而激活AMPK介导的adipoR1通路活性,引起了 2型糖尿病的改善。2.DJB术后的糖尿病大鼠胰岛素敏感性得到改善,但经慢病毒介导的人为的增加肝脏miR-320的表达可引起糖尿病的复发。