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目的:为对比研究各种卵巢癌抗原HS-exosomes致敏树突状细胞介导的卵巢癌特异性的免疫治疗效果,制备卵巢癌exosomes、HS-exosomes、热休克蛋白、冻融抗原。方法:采用超速、梯度离心法从卵巢癌A2780、SKOV3细胞培养上清液中分离纯化肿瘤细胞分泌的HS-exosomes、Exosomes;采用透射电镜观察其超微结构;用冻融法制备肿瘤冻融抗原(frozen tomor antigen,FTA);用经43℃热处理5小时的卵巢癌细胞,制备细胞裂解液,利用层析分离纯化出热休克蛋白,经电泳及Western-blot进行蛋白分子定量。结果:制备的exosomes与HS-exosomes经电镜鉴定为:它是一类直径大约30-90nm的双层膜性囊泡小体,对照文献可确定为exosomes与HS-exosomes。热休克的卵巢癌细胞的裂解液纯化后经鉴定含有相对分子量为70Kd的HSP70蛋白。结论:从经热休克处理或未经热休克处理的卵巢癌细胞培养上清液中均能分离纯化出直径大小为30-90nm的双层膜性囊泡样小体,经电镜鉴定从中分离的小体具有exosomes小体典型的形态特征,我们将经热休克处理后卵巢癌细胞分泌的小体归类为HS-exosomes小体,而未经热休克处理的卵巢癌细胞分泌的小体归类为exosomes小体。同时经热休克处理的卵巢癌细胞裂解液中富含HSP70。目的:对比研究卵巢癌抗原致敏树突状细胞的功能及其在体外诱导细胞毒性T淋巴细胞CTL特异性杀伤卵巢癌细胞的效果。方法:取健康志愿者外周血,密度梯度离心分离单核细胞(PMBC),用GM-CSF、IL-4等细胞因子刺激刺激,培养大量DC,在其培养体系中分别加入exosomes、HS-exosomes、热休克蛋白、冻融抗原,制备负载抗原的DC(Ag-DC),用ELISA法对Ag-DC和未被修饰DC培养上清液的IL-12、TNF-α含量进行检测;从外周血中获取T淋巴细胞,诱导增殖CTL,加入Ag-DC,用MTT法检测抗原致敏DC诱导T细胞增殖的能力;将健康人外周血单个核细胞通过PHA、IL-2、抗CDS单抗、IFN刺激,诱导分化制备大量的LAK、CDSAK、CIK细胞。将LAK、CDSAK、CIK、T淋巴细胞分别与Ag-DC混合培养,诱导的LAK、CDSAK、CIK、CTL细胞作为效应细胞,按效靶比为25:1的比例将效应细胞加入到靶细胞(A2780、SKOV3)培养体系中,利用乳酸脱氢酶(LDH)4小时释放法测定效应细胞对靶细胞的杀伤活性。结果:从健康外周血获得的PMBC,经GM-CSF、IL-4刺激培养7d后,电镜下观察细胞为不规则形,细胞表面粗糙突起明显,细胞核呈肾形和马蹄形,经FCM鉴定,可确定为DC。ELISA法对抗原修饰的DC和未被修饰DC上清液的IL-12、TNF-α含量进行检测,结果表明:所观察的四种抗原均能致敏DC,经致敏的DC所分泌的IL-12和TNF-α的量均显著增加,其中以HS-exosomes-DC分泌的细胞因子量为最高,经卵巢癌抗原冲击致敏DC刺激T细胞增殖的强度,显著高于未致敏DC(p<0.01);HS-exosomes-DC刺激T淋巴细胞增殖强度与其它三组抗原致敏DC刺激T淋巴细胞增殖强度相比有显著性差异,(p<0.05);而抗原致敏DC、热休克蛋白-DC、Exosomes-DC三组间相比较对刺激T淋巴细胞增殖无显著性差异(p>0.05)。四种卵巢癌细胞抗原致敏DC诱导的DC-CTL对同种卵巢癌细胞均表现出较强的杀伤活性,但以HS-exosomes-DC诱导的DC-CTL的杀伤活性最强,与冻融抗原-DC相比有差异P<0.05,而与Exosomes-DC-CTL、热休克蛋白-DC-CTL两组之间无明显的差别,未激化T淋巴细胞对卵巢癌细胞无杀伤作用。结论:本研究制备的四种卵巢癌四种抗原在体外均能致敏DC,致敏DC分泌的IL-12和TNF-α细胞因子及刺激T细胞增殖等功能均显著提高,而且致敏DC诱导的CTL杀瘤活性也显著高于未致敏DC诱导的CTL杀瘤活性,制备的4种卵巢癌抗原致敏DC的功能强度存在一定的差异。