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新城疫（Newcastle Disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）所致的一种高度接触性传染病,能引起鸡、火鸡、鸭、鸽子和鹦鹉等多种禽类的感染和死亡,是严重危害世界养禽业的禽病之一。国际兽疫局将其定为A类疫病,我国也将其列为一类动物疫病。目前,用于防治该病的疫苗主要为弱毒苗和油乳剂灭活苗。弱毒苗价格低、效果好,但易导致病毒散播;灭活苗安全可靠,但存在免疫期短、成本高、使用较复杂的缺点。因而具有高特异性、研制简单、不散毒等优点的核酸疫苗成为了现代疫苗的研究热点。但研究也发现核酸疫苗存在免疫原性不强、质粒DNA可能整合到宿主DNA上引起病理和毒理反应等不足。因此,人们期望从分子佐剂、开发有效的DNA运输载体等方面,提高核酸疫苗的免疫效果和改善其安全性。本试验将鸡新城疫病毒F基因和鸡源性白细胞介素18基因（Chicken Interleukin—18,ChIL-18）构建成融合基因F-ChIL-18,并将其克隆到由甲病毒改建的“自杀性”质粒上,构建成融合表达F-ChIL-18基因的“自杀性”质粒pSFV-F-ChIL-18。然后将该质粒与菌蜕结合,制备成pSFV-F-ChIL-18核酸菌蜕疫苗,以观察ChIL-18对NDV F基因核酸菌蜕疫苗是否有免疫增强作用。1.pSFV-F-ChIL18核酸疫苗的构建根据GeneBank公布的鸡新城疫病毒（NDV）Lasota株F基因和鸡源性白细胞介素18（ChIL-18）基因序列分别设计特异性引物,且在鸡NDV F基因引物上游引入BamHⅠ位点、下游引入SalⅠ位点,在ChIL-18基因引物上游引入SalⅠ位点、下游引入HindⅢ、BamHⅠ位点。以鸡新城疫病毒Lasota株RNA为模板RT-PCR扩增F基因,并将其克隆到pMD18-T中。再扩增上游带有SalⅠ位点、下游带有HindⅢ、BamHⅠ位点的ChIL-18基因,也将其插入到含有F基因的质粒pMD18-T-F′中,使两个基因首尾相连,且F基因不含终止密码子,ChIL-13基因不含起始密码子。最后将融合基因片段定向克隆到pSFV单一启动子（CMV）下游,构建成F-ChIL-18融合基因重组“自杀性”质粒pSFV-F-ChIL-18。同时,用上下游均含有BamHⅠ位点的引物,扩增NDV F基因,将扩增产物正向插入pSFV质粒,构建成pSFV-F重组质粒。2.pSFV-F-ChIL18核酸菌蜕疫苗的制备将含有裂解质粒（pHH43）的大肠杆菌DH5a于28℃,200rpm摇床培养,为获得最大量的菌蜕,当OD600=0.4～0.6时,迅速升高培养温度至42℃以启动E裂解蛋白的表达并开始计时,4小时后收集菌蜕。菌落计数（CFU）结果表明有99.98%的细菌被有效裂解。扫描电镜观察可见裂解孔道位于细菌一端或中间,而胞内的物质已经排出,菌蜕保留了较完整的外膜,细菌形态没有发生太大改变。将质粒pSFV-F-ChIL-18与pSFV-F重悬于含有菌蜕的的PBS（pH7.4）体系中,加入终浓度25mM CaCl2溶液,37℃,150rpm,30min摇床孵育,制备成核酸菌蜕疫苗。经8000rpm,离心10min,分离上清和沉淀。通过测定上清液的OD260/280,以确定菌蜕疫苗DNA的量,最终以100ug/羽的量接种鸡进行免疫试验。3.新城疫核酸菌蜕疫苗的免疫试验将150只1日龄非免疫雏鸡随机分成5组,分别为:pSFV-F-ChIL-18菌蜕疫苗免疫组（Ⅰ组）、pSFV-F-ChIL-18疫苗免疫组（Ⅱ组）、pSFV-F菌蜕疫苗免疫组（Ⅲ组）、新城疫Lasota株弱毒冻干苗免疫组（Ⅳ组）、空白对照组（Ⅴ组）。分别于7日龄和21日龄对Ⅰ组肌肉注射pSFV-F-ChIL-18菌蜕疫苗（100ug/羽）:Ⅱ组肌肉注射pSFV-F-ChIL-18疫苗（100ug/羽）;Ⅲ组肌肉注射pSFV-F菌蜕疫苗（100ug/羽）;Ⅳ组用新城疫Lasota株弱毒冻干苗进行点眼与滴鼻（剂量参照说明书）、Ⅴ组不做任何处理。通过间接ELISA及攻毒保护试验,对新城疫核酸疫苗的免疫效果进行的评定。间接ELISA测定免疫鸡外周血IL-2、INF-γ含量结果为:pSFV-F-ChIL-18核酸菌蜕疫苗组与pSFV-F-ChIL-18核酸疫苗组IL-2、INF-γ诱导水平明显高于pSFV-F核酸菌蜕疫苗组（P＜0.01）。试验鸡新城疫抗体检测结果为:核酸菌蜕疫苗各组均诱导动物机体产生特异性免疫应答,但免疫原性较弱,抗体水平低,显著低于新城疫Lasota株弱毒苗组（P＜0.01）。pSFV-F-ChIL-18核酸菌蜕疫苗免疫组和pSFV-F核酸菌蜕疫苗组抗体水平显著高于pSFV-F-ChIL-18核酸疫苗（P＜0.05）。攻毒保护试验结果为:弱毒苗攻毒保护率为100%、pSFV-F-ChIL-18菌蜕菌蜕攻毒保护率为60%,pSFV-F核酸菌蜕疫苗组保护率为50%,pSFV-F-ChIL-18核酸疫苗组保护率为40%。