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帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是仅次于阿尔兹海默症的第二大常见的神经退行性疾病,常见于中老年人。PD的病理特征是黑质致密部（substantia nigra pars compacta,SNpc）多巴胺能神经元损伤,导致一系列的运动功能障碍。但目前其病因和发病机理尚不完全清楚。越来越多的证据证实PD患者黑质（substantia nigra,SN）中铁水平显著增加,SN铁沉积可能是PD发病的重要原因之一。过多不稳定的铁通过Fenton反应催化活性氧（reactive oxygen species,ROS）的生成,加重多巴胺能神经元的氧化应激损伤;铁还是铁死亡的重要参与者,铁死亡是早在2012年由Brent R.Stockwell教授发现并命名的铁依赖性细胞程序性死亡方式。已有研究证实铁死亡与PD发病密切相关。因此,抑制铁沉积和铁死亡可能是防治PD的重要策略。铁蛋白是一种重要的细胞内铁贮存蛋白,可以通过螯合铁来维持细胞铁稳态。铁蛋白主要由铁蛋白重链（heavy chain ferritin,H-Ferritin）和铁蛋白轻链（light chain ferritin,L-Ferritin）组成。H-Ferritin具有氧化二价铁的亚铁氧化酶活性。L-Ferritin的成核位点通过促进铁核的形成来完成铁的贮存。当机体铁过量时,可将多余的铁贮存在铁蛋白中;当机体铁缺乏时,铁蛋白则通过释放贮存的铁来维持机体铁平衡。而近期研究结果表明铁蛋白可能被分泌至细胞外,且细胞外铁蛋白能够通过H-Ferritin与转铁蛋白受体1（transferrin receptor,Tf R1）的特异性结合转运至细胞内。去铁铁蛋白（apoferritin）是一种不含铁的蛋白,来源于马脾血清。它由24个亚基组成,具有存贮铁的能力,能够通过血脑屏障进入脑内,提示apoferritin可能通过调节脑内铁稳态参与PD铁沉积的调节。因此,本实验选用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP）诱导的PD小鼠模型,通过Western Blot、免疫荧光、铁染色及行为学等实验技术研究了apoferritin对MPTP诱导的PD小鼠模型多巴胺神经元损伤、铁沉积及铁死亡的影响及可能的机制,结果如下:1.小鼠体重变化结果显示MPTP处理的PD小鼠的体重与对照组相比明显降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。应用10 mg/kg或15 mg/kg apoferritin预处理可以有效拮抗MPTP引起的小鼠体重的下降,差异有统计学意义（P<0.05）。Apoferritin单独处理组和对照组相比,差异无统计学意义。2.爬杆实验结果表明与对照组相比,MPTP处理组的下杆时间和转头时间明显延长,10 mg/kg apoferritin或15 mg/kg apoferritin预处理均能够明显改善MPTP诱导的爬杆能力的障碍,与MPTP组相比,差异有统计学意义（P<0.05）。而10 mg/kg apoferritin预处理组与15 mg/kg apoferritin预处理组相比无显著差异。因此,选用10 mg/kg apoferritin预处理进行后续实验。Apoferritin单独处理组和对照组相比,差异无统计学意义。3.旷场测试结果表明MPTP处理组小鼠的总移动距离与对照组相比明显下降,差异具有统计学意义（P<0.01）。而10 mg/kg apoferritin预处理组小鼠的总移动距离与MPTP组相比明显增加,差异有统计学意义（P<0.05）。4.行为学实验结果表明灌胃和静脉注射apoferritin（10 mg/kg）均能明显改善MPTP诱导的PD小鼠的运动障碍,且灌胃给药组与静脉注射给药组相比,小鼠下杆时间和转头时间无显著差异。因此,选用灌胃途径进行后续实验。5.MPTP处理后,与对照组相比,小鼠SN区TH阳性细胞数和TH蛋白表达水平明显减少,差异具有统计学意义（P<0.001）。10 mg/kg apoferritin预处理后可以有效拮抗MPTP诱导的小鼠SN区TH的丢失及TH蛋白表达的下降,差别有统计学意义（P<0.05）。6.MPTP处理后,与对照组相比,小鼠SN区Iba1阳性细胞数显著增加,差异有统计学意义（P<0.01）。Apoferritin预处理后,与MPTP组相比,小鼠SN区的Iba1阳性细胞数显著减少,差异有统计学意义（P<0.05）。7.MPTP处理后,与对照组相比,小鼠SN区铁阳性细胞数明显增加,差别具有统计学意义（P<0.001）。Apoferritin预处理后可有效的抑制小鼠SN区铁阳性细胞数的增加,差异具有统计学意义（P<0.05）。8.MPTP处理后,与对照组相比,小鼠SN区铁转入蛋白二价金属转运蛋白1（divalent metal ion transporter,DMT1）蛋白的表达水平明显增加,转铁蛋白受体1（transferrin receptor,Tf R1）蛋白的表达水平下降,差异有统计学意义（P<0.01）。Apoferritin预处理后可以有效抑制MPTP诱导的小鼠SN区DMT1的表达上调和Tf R1的表达下调,差异有统计学意义（P<0.05）。9.MPTP处理后,与对照组相比,小鼠SN区的铁死亡相关蛋白长链脂酰辅酶A合成酶4（long-chain acyl-Co A synthetases 4,ACSL4）的蛋白表达明显增加,而铁死亡抑制蛋白1（ferroptosis suppressor protein1,FSP1）蛋白水平明显下降,差异具有统计学意义（P<0.01）。给予apoferritin预处理后,可有效抑制MPTP诱导的ACSL4蛋白的增加及FSP1的下调,差异具有统计学意义（P<0.05）。10.MPTP处理后,与对照组相比,小鼠SN区的铁死亡蛋白谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4,GPX4）的蛋白表达降低而apoferritin预处理未改变GPX4的蛋白表达水平。MPTP处理后,小鼠SN区谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽（glutathione/oxidized glutathione,GSH/GSSG）的表达水平无明显变化,差异无明显的统计学意义。11.给予3μg apoferritin侧脑室注射30 min后,与假手术组相比,小鼠脑脊液和血清中L-Ferritin水平显著增加,差异具有统计学意义（P<0.05）。给予3μg apoferritin侧脑室注射1 h、3 h、6 h、12 h、24 h后,1 h和3 h组小鼠脑脊液中L-Ferritin的水平与假手术组相比显著增加,差异具有统计学意义（P<0.001）。3μg apoferritin侧脑室注射6 h组小鼠SN区L-Ferritin水平明显上调,与假手术组相比,差别有统计学意义（P<0.01）。12.免疫印迹实验结果显示,与对照组相比,apoferritin处理后原代培养的VM神经元和小鼠SN区L-Ferritin的蛋白表达明显增加,与对照组相比有统计学意义（P<0.05）;而apoferritin处理并不影响原代培养的腹侧中脑神经元（Ventralmesencephalon,VM）和小鼠SN区H-Ferritin的蛋白表达。综上所述,本实验研究了apoferritin对MPTP诱导的PD小鼠模型的神经保护作用和可能的机制。证实apoferritin能够通过恢复SN中TH蛋白的表达和TH阳性神经元的数量显著改善MPTP诱导的运动功能障碍。此外,apoferritin预处理可通过下调铁转入蛋白DMT1来抑制MPTP诱导的SN铁聚集。同时,apoferritin可通过抑制小鼠SN中ACSL4的上调和FSP1的下调来有效预防MPTP诱导的铁死亡。这些结果表明,apoferritin通过抑制铁的聚集和调节铁死亡而发挥神经保护作用。以上结果为PD的治疗提供了新靶点和新思路。