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沙门菌是当前最为重要的人兽共患病病原菌之一,能够引起人和多种动物的急性或慢性传染病。沙门菌能通过污染禽源性食品引起人的食物中毒,而养禽业滥用抗生素导致的沙门菌耐药性增加也给人类的生命安全带来严重威胁。因此,禽沙门菌病的防制具有十分重要的公共卫生学意义。禽沙门菌的流行情况与耐药性随着时间和环境的变化而不断改变,因此有必要对其进行持续跟踪调查。在禽沙门菌病中危害养鸡业最严重的是鸡白痢,该病由鸡白痢沙门菌引起,发病率高,既可水平传播又可垂直传播。在没有可靠疫苗使用的情况下,开展鸡白痢的净化工作是防控该病的重要措施。养殖场往往使用玻板凝集试验进行检疫,淘汰阳性鸡,而鸡白痢染色抗原是该检疫方法的关键。我国目前使用的标准染色抗原是用早年分离的鸡白痢沙门菌标准株C79-1和变异株C79-7制备而成,但近几年在实际应用中发现,该染色抗原的敏感性不够,因此有必要对抗原制备菌株进行进一步筛选。 本研究首先对2015-2016年华东地区临床疑似禽病料进行沙门菌分离,利用多重PCR方法及诊断血清进行鉴定,通过药敏试验测定沙门菌的耐药性,为禽沙门菌的防控提供流行病学数据支撑。其次,通过对鸡白痢沙门菌标准株C79-1、变异株C79-7及野生株的抗原性差异分析和对抗原制备培养基的评价,分析了我国现行标准抗原的亟待改进之处。最后从68株鸡白痢沙门菌分离株中筛选得到适宜的抗原制备菌株,确定了染色抗原的制备方法,并在对自然感染鸡的检测效果上与标准抗原进行了比较。 1.2015-2016年华东地区禽沙门菌的分离鉴定及耐药性分析 从2015-2016年华东地区疑似沙门菌病家禽病料中进行沙门菌的分离培养,利用多重PCR法和血清诊断法进行血清型鉴定。结果显示,共分离到68株沙门菌,其中鼠伤寒沙门菌33株,鸡白痢沙门菌29株,肠炎沙门菌4株,纽波特沙门菌1株,邦戈尔沙门菌1株。鸡源分离株以鸡白痢沙门菌感染为主,占比为82.86%;鹅源和鸽源分离株以鼠伤寒沙门菌感染为主,占比分别为90.90%和85.71%。一年中沙门菌分离率较高的月份为3月、4月和7月。纸片扩散法测定沙门菌分离株对23种抗生素的药敏试验结果显示,当前沙门菌临床分离株对青霉素、苯唑西林、红霉素、利福平和万古霉素的耐药率均达90%以上,尤其对苯唑西林、利福平和万古霉素的耐药率达到了100%。对6种及以上抗生素的多重耐药率达86.76%,可见当前禽沙门菌临床分离株的多重耐药现象仍十分严重。90%以上的分离株对头孢唑啉、头孢西丁、庆大霉素、新霉素、阿米卡星、氟苯尼考和氯霉素较为敏感。 2.我国鸡白痢凝集抗原生产用培养基的评价和菌株的抗原性分析 通过比较鸡白痢沙门菌标准株C79-1、变异株C79-7及各野生株在LB和TG培养基的生长情况与连续传代后的抗原性变化,确定生产抗原适宜的培养基。同时对高免血清和自然感染鸡血清进行玻板凝集试验,比较鸡白痢沙门菌各野生株、标准株C79-1和变异株C79-7在敏感性、特异性及广谱性方面的差异。试验结果表明,与LB相比,TG培养基不但可以明显提高各菌株的生长速度,而且经过传代后可以提高抗原的敏感度,因此TG为生产抗原较适宜的培养基。抗原差异比较结果发现,C79-1和C79-7抗原的广谱性优于各野生株,但野生株抗原检测当前鸡白痢流行株血清的敏感性要高于C79-1和C79-7。因此,在制备抗原时,可筛选适合的鸡白痢沙门菌流行株作为目前我国标准抗原的补充。 3.鸡白痢凝集抗原的筛选和制备 运用玻板凝集试验对从华东地区临床分离的68株鸡白痢沙门菌进行交叉凝集价测定,初步筛选出抗原制备候选菌株。通过对50只人工感染鸡抗体水平的动态监测和对100份自然感染鸡血清样品的检测,进一步比较各候选抗原的特异性、敏感性和广谱性。比较各候选菌株的生长速度和在人工培养基上的稳定性,筛选出抗原制备菌株,确定自制抗原的组分。最后利用自制抗原对自然感染鸡血清进行了检测,并与中监所抗原进行了比较。结果,鸡白痢沙门菌分离株S44确定为抗原制备菌株,自制抗原的组分为50%的标准株C79-1和50%的野生株S44。在对三个自然感染鸡群的检测中,自制抗原的总阳性率比中监所抗原分别提高2.00%,8.43%和33.33%,强阳性率分别提高7.00%,7.36%和19.29%。因此,与中监所抗原相比,自制抗原的敏感性有所提高,可用于鸡白痢的净化。