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肺癌是所有恶性肿瘤中发病率最高、病死率最高的一种疾病,目前已是世界范围内恶性肿瘤致死的首位因素。2018年中国最新癌症报告显示,中国每年肺癌发病约78.1万,死亡病例约62.6万。根据生物学特性,肺癌可分为非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)两大类。其中,NSCLC占所有病例的80%~85%。虽然肺癌的基础研究和治疗方面取得了一些突破,但近30年来肺癌患者的5年生存率仍然停留在15%左右。肺癌的侵袭和转移能力强是导致肺癌治疗效果不佳的罪魁祸首,临床上近80%的NSCLC在确诊时已经发生了区域淋巴结或者远处脏器的转移。因此深入揭示肺癌侵袭和转移的分子机制具有重要的理论和临床价值,通过对这些分子的检测,不仅有助于判断肺癌的转移与预后,而且也可为阻断肺癌的侵袭和转移提供了有价值的分子靶标。蛋白质的泛素化降解途径是泛素与一系列关联酶协同作用,降解泛素化的蛋白质的过程。这一过程中的系列关联酶主要由泛素激活酶(Ubiquitin-activating enzyme,E1)、泛素结合酶(Ubiquitin-conjugating enzyme,E2)与泛素连接酶(Ubiquitin ligase,E3)组成,E3连接酶具有特异性识别靶蛋白的功能,在泛素途径中具有极其重要的作用。目前已知的E3泛素连接酶主要有两类:HECT和RING结构域家族。大量研究表明E3泛素连接酶和肿瘤的发生发展、侵袭转移等密切相关。通过分析GEO Data Set发现E3泛素连接酶环指蛋白RNF38(Ring Finger Protein 38)在肺癌中表达明显上调;RNF38基因定位于9号染色体短臂13区2带(9p13.2),该基因目前发现有多个转录变体编码不同的亚型,作为E3泛素连接酶之一,RNF38的功能目前还不清楚;有研究表明,RNF38泛素化的底物有抑癌基因p53,其可通过泛素化作用调节p53的亚细胞定位,因此RNF38可能与肿瘤发生、细胞内信号转导及细胞凋亡等相关。本研究拟通过q RT-PCR、Western blot以及免疫组织化学在NSCLC组织与其癌旁正常组织中检测RNF38的m RNA和蛋白表达差异。构建208例NSCLC组织芯片,免疫组织化学检测RNF38的表达,结合NSCLC组织临床病理特征,分析RNF38表达与NSCLC组织临床病理特征间的关系。检测不同NSCLC细胞中RNF38表达,应用RNA干扰技术调节RNF38表达,检测不同RNF38表达的NSCLC细胞侵袭与增殖情况。并研究RNF38表达对上皮与间皮标记的影响;通过免疫共沉淀结合质谱分析研究RNF38相互作用蛋白,进一步验证RNF38与其相互作用蛋白关系后,调节RNF38相互作用蛋白表达,检测后者对前者功能影响。在NSCLC细胞与工具细胞中研究RNF38与其相互作用蛋白的关系,在组织水平验证,利用免疫组织化学在组织芯片检测RNF38相互作用蛋白表达,分析其与NSCLC患者临床病理特征的关系。结合RNF38表达分析两者在NSCLC患者预后预测中的意义。第一部分E3连接酶RNF38在NSCLC中表达及与NSCLC临床病理特征的关系研究目的:通过多种实验方法研究RNF38蛋白在NSCLC及其对应癌旁组织中的表达情况,明确其表达与NSCLC患者临床病理参数的关系。方法:应用实时荧光定量PCR、蛋白免疫印迹等实验方法检测30例NSCLC及对应癌旁组织中RNF38的表达,初步明确其在NSCLC组织中的表达趋势;并进一步应用大样本量组织免疫组织化学检测证实;并结合患者临床病理特征,利用SPSS软件分析RNF38表达与208例NSCLC癌患者临床病理参数的关系。结果:RNF38在NSCLC组织中表达高于其在相应癌旁组织中的表达(RNF38 m RNA,3.43±0.33 vs.1.83±0.21)、(RNF38蛋白,2.98±0.36 vs.1.63±0.21);208例NSCLC肺癌组织中RNF38阳性表达占48.8%(102/208),而癌旁组织中相应表达只占10.1%(p<0.05)。RNF38蛋白表达高水平与肿瘤大小(p=2.09E-04)、TNM分期(p=0.011)、淋巴结转移(p=4.43E-05)肿瘤分型(p=0.030)及血管侵犯(p=0.001)有关,而与肺癌患者年龄(p=0.155)、性别(p=1.000)及肿瘤组织分化(p=0.403)等因素无关。结论:RNF38在NSCLC组织中高表达,其表达与NSCLC恶性表型正相关。第二部分RNF38诱导细胞上皮-间质转化促进NSCLC侵袭转移目的:研究RNF38表达对NSCLC细胞生物学功能的影响及机制。方法:荧光定量PCR与Western blot检测多株NSCLC细胞系中RNF38的表达差异;通过RNA干扰技术在高表达RNF38的NSCLC细胞调节RNF38表达,建立稳定细胞株;CCK-8实验检测细胞增殖能力变化;Transwell与划痕实验研究细胞侵袭与移动能力变化。最后探讨RNF38诱导NSCLC侵袭转移的分子机制。结果:RNF38高表达于95-D、A549细胞,而低表达于95-C、H460与16HBE细胞;构建稳定RNF38干扰细胞后,研究发现高表达RNF38促进NSCLC细胞的侵袭与迁移,且促进细胞增殖。蛋白质印迹与免疫荧光检测发现,RNF38干扰后上皮标志E-cadherin表达上调,而间皮标志Vimentin表达下调。结论:RNF38诱导NSCLC细胞上皮-间质转化而促进NSCLC侵袭与迁移。第三部分RNF38泛素化降解DSG1蛋白参与NSCLC侵袭转移目的:探索泛素链接酶RNF38诱导NSCLC细胞进展的分子机制。方法:应用免疫共沉淀、液相质谱技术及生物信息学筛选与RNF38相互作用蛋白,并进一步确定其作用底物。通过干扰、蛋白免疫印迹及侵袭实验等确定RNF38诱导NSCLC进展的机制。结果:免疫共沉淀结合液相质谱和生物信息学分析筛选出13个RNF38相关蛋白,通过生物学分析RNF38干扰后细胞生物学功能、免疫沉淀后蛋白质印迹分析确定RNF38底物为DSG1,且发现RNF38通过调节DSG1蛋白稳定进而影响NSCLC细胞侵袭。结论:E3链接酶RNF38通过泛素化降解DSG1促进NSCLC进展。第四部分RNF38与DSG1蛋白表达与NSCLC患者预后相关目的:检测DSG1在NSCLC及其对应癌旁组织中的表达,分析DSG1与NSCLC临床病理间的关系;结合随访资料分析RNF38和DSG1与NSCLC患者预后的关系。方法:应用组织芯片中免疫组织化学检测DSG1的表达,分析DSG1与RNF38的相关性,DSG1与NSCLC患者临床病理特征间的关系;结合随访资料分析RNF38和DSG1与NSCLC预后的关系。结果:DSG1在NSCLC组织中表达低于其在相应癌旁组织中的表达,且RNF38与DSG1在NSCLC组织中表达呈负相关。208例NSCLC肺癌组织中DSG1阳性表达占43.3%(90/208),而癌旁组织中相应表达占60.1%(p<0.05)。DSG1蛋白表达水平与肿瘤分级(p=0.010)、淋巴结转移(p=3.7E-05)及肿瘤大小(p=0.001)有关,而与肺癌患者年龄(p=0.094)、性别(p=0.877)、肿瘤组织分化(p=0.261)等因素无关。Kaplan-Meier生存分析显示高表达RNF38患者预后较低表达RNF38患者差(p=0.012),DSG1低表达患者预后较DSG1高表达患者差(p=0.032),而RNF38高表达/DSG1低表达患者生存预后较RNF38低表达/DSG1高表达患者明显要差(p=0.003)。Cox单因素分析表明影响肺癌生存预后的因素包括:肿瘤大小(p=9.76E-06)、淋巴结转移(p=3.47E-09)、肿瘤分级(p=4.65E-08)、RNF38表达(p=0.013)与DSG1缺失(p=0.033)。在Cox多因素分析之后,得知淋巴结转移(p=0.001)、肿瘤大小(p=0.002)、肿瘤分级(p=0.046)及RNF38/DSG1表达(p=0.043)是影响总生存率的独立预后因素。结论:RNF38高表达与DSG1低表达患者总体生存率低,RNF38高表达与DSG1低表达是NSCLC预后因素。因此,RNF38与DSG1蛋白可作为预测NSCLC患者预后的新的肿瘤标记物及生物治疗的新标靶。