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目的:本实验室前期的研究发现miR-34a可通过负向调控Treg关键转录因子叉头/翼状螺旋转录因子3（Forkhead/winged helix transcription factor 3,Foxp3）抑制iTreg再分化,从而促进胶原诱导性关节炎（Collagen-induced arthritis,CIA）病程进展,同时证实在类风湿性关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）患者的血清中miR-34a的表达增加。Foxp1是B细胞分化发育相关的重要转录因子,文献报道miR-34a可通过抑制Foxp1的表达调控B细胞的分化、发育和成熟,而B细胞在RA的发病中具有重要作用,因此我们推测miR-34a可能通过调控B细胞的再分化、活化和免疫记忆,促进RA的发生、发展。本研究通过构建miR-34a基因敲除鼠,进而采用miR-34a基因敲除和转基因小鼠建立CIA模型,研究miR-34a对外周B细胞亚群的再分化调控,从而影响CIA发生、发展。阐明miR-34a在RA发生、发展中的作用以及对B细胞调节的初步机制。方法:1.在http://crispor.tefor.net/crispor.cgi网站上设计针对miR-34a特异性打靶位点的小向导RNA（small guide RNA,sgRNA）序列,然后制备Cas9mRNA和sgRNA,将其显微注射到DBA1/J鼠受精卵的胞质中,在特定的细胞培养基中进行培养,当细胞分裂至两细胞胚胎阶段时将其转入10周龄ICR假孕雌鼠体内,进行繁育、鉴定。2.通过流式细胞术（Flow cytometry,FCM）检测8-12周miR-34a-/-DBA1/J小鼠体内免疫器官中的T、B细胞的比例。3.采用6-8周野生型DBA1/J、miR-34a-/-DBA1/J小鼠、野生型C57BL/6和miR-34a TG C57BL/6小鼠建立CIA模型,第0天在小鼠尾根部3厘米处注射牛Ⅱ型胶原蛋白（Bovine type II collagen,CⅡ）和弗式完全佐剂（Freund’s complete adjuvant,CFA）乳化物,第21天在小鼠尾根1-2厘米处部注射CⅡ和弗式不完全佐剂（Freund’s complete adjuvant,IFA）乳化物,完成免疫小鼠。从免疫第0天开始,每隔3天观察小鼠并记录小鼠体重;第21天第二次免疫之后,每隔2天观察小鼠发病状态并对小鼠的四个踝关节的炎症评分,拍照记录CIA小鼠的发病情况,病理学切片（HE染色）检查观察小鼠关节炎症状况、钼靶拍摄观察小鼠骨质变化,直到第42天为止。4.分离CIA模型小鼠外周免疫器官中的淋巴细胞,采用荧光抗体染色和流式细胞术检测CIA小鼠脾脏和淋巴结组织中的总B细胞、GC B细胞（Germinal center B cell,GC B cell）、MZ B（Marginal B cell,MZ B cell）细胞、浆细胞（plasma cells）的表面标志和比例。结果:1.利用CRISPR/Cas9技术成功构建miR-34a-/-DBA1/J小鼠,FCM分析发现miR-34a-/-DBA1/J小鼠体内免疫器官中CD4+、CD8+T细胞群体未见显著变化,但是总B细胞比例明显增加,这表明miR-34a可能对CD4+、CD8+T细胞分化、发育没有显著影响,但是影响B细胞再分化、发育。2.以miR-34a-/-DBA1/J小鼠和miR-34a TG C57BL/6小鼠建立CIA模型,CIA组小鼠在第25天左右陆续发病,产生关节炎症。miR-34a TGC57BL/6 CIA组小鼠的关节发炎、红肿程度相较于野生型C57BL/6 CIA组小鼠更为严重;野生型DBA1/J CIA组小鼠关节炎症程度比miR-34a-/-DBA1/J CIA组小鼠严重。两者炎症评分、影像学和病理学检测一致。3.在miR-34a TG C57BL/6小鼠体内中,外周总B细胞比例下降,但是miR-34a TG C57BL/6 CIA组小鼠关节炎症反应比较严重;在miR-34a-/-DBA1/J小鼠体内,外周总B细胞比例增加,miR-34a-/-DBA1/J CIA组小鼠炎症程度较轻,炎症周期延长。4.深入分析各CIA组小鼠的体内B细胞亚群发现,miR-34a-/-DBA1/J CIA组小鼠体内GC B、MZ B细胞比例均下降,而miR-34a TG C57BL/6 CIA组小鼠体内GC B、MZ B细胞比例增加。结论:在CIA模型中,miR-34a可能通过调控B细胞再分化、发育促进CIA疾病的进展。本研究有可能为RA的基础、临床研究和诊疗提供新的研究思路。