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目的:乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)相关慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure, ACLF)是由HBV感染引起的肝细胞大量坏死和凋亡,继而出现严重肝功能损害和各种并发症的临床综合征,其发病急,病情凶险,占我国所有肝衰竭病因的80%以上。HBV相关ACLF的发病机制非常复杂,目前认为是病毒和宿主相互作用的结果,其中HBV在一定条件下引起的宿主免疫反应异常是其发病的主要环节。本研究通过动态观察HBV相关ACLF患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞频率的变化规律,肝组织内Foxp3+细胞的表达及分布,血清干扰素(interferon, IFN)-γ和白细胞介素-10(interleukin 10, IL-10)的水平及两者的比值,旨在探讨CD4+CD25+调节性T细胞与HBV相关ACLF的发病及临床预后的相关性。方法:收集HBV相关ACLF患者32例,慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)患者44例及41例献血员作为正常对照组,并收集接受肝移植的ACLF患者及正常供体肝组织各6例。HBV相关慢加急性肝衰竭和CHB的诊断分别符合亚太肝病学会制定的《慢加急性肝衰竭的共识推荐》、中华医学会肝病学分会及中华医学会感染病学分会联合制定的2006年版《肝衰竭诊疗指南》和2005年版《慢性乙型肝炎防治指南》的标准。检测患者肝功能,凝血功能,HBV血清学标志物和HBV DNA载量;应用流式细胞术检测外周血CD4+CD25+调节性T细胞频率,并动态观察其在HBV相关ACLF患者中的变化规律;免疫组织化学观察Foxp3+细胞在肝组织中的表达及分布特点;逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)检测外周血单个核细胞及肝组织中Foxp3 mRNA的表达;酶联免疫吸附法测定血清IFN-γ和IL-10水平。比较外周血CD4+CD25+调节性T细胞在HBV相关ACLF患者存活组和死亡组间的差异及各自变化趋势,并与MELD评分进行相关性分析,探讨其与临床预后的关系。结果:1 ACLF组、CHB组及正常对照组人口学及临床特点各组患者的年龄和性别比例具有可比性。ACLF组患者ALT、AST、TBIL、DBIL、血肌酐和国际标准化比率(international normalized ratio, INR)显著高于CHB组和正常对照组,差异具有统计学意义(均P < 0.05)。ACLF组与CHB组比较,血清HBV DNA载量和HBeAg阳性率无统计学差异。ACLF患者中共22例出现严重并发症,其中肝性脑病9例,自发性细菌性腹膜炎11例,肝肾综合征5例及食管静脉曲张破裂出血2例。2 ACLF患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞频率升高ACLF组外周血CD4+CD25+调节性T细胞频率(6.33%±1.49%)明显高于CHB组(vs. 4.16%±1.31%)和正常对照组(vs. 2.20%±0.69%),差异均具有统计学意义(均P < 0.001)。而CHB组与正常对照组比较,差异也具有统计学意义(P < 0.001)。ACLF组中,有并发症患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞频率(6.51%±1.50%)高于无并发症患者(vs. 5.94%±1.42%),但两组比较差异无统计学意义(P = 0.55)。3 ACLF患者肝组织中Foxp3+细胞的浸润增多ACLF患者肝组织浸润的Foxp3+细胞(14.7±3.6/hpf)显著高于CHB患者(vs. 4.6±1.4/hpf)和正常对照组(vs. 0.4±0.2/hpf),差异具有统计学意义(均P < 0.001)。Foxp3+细胞主要分布在淋巴细胞聚集及炎症明显的汇管区,而肝窦内亦可见散在分布。4 ACLF患者外周血单个核细胞及肝组织中Foxp3 mRNA的表达增多ACLF患者外周血单个核细胞中Foxp3 mRNA相对表达量为0.78±0.16,显著高于CHB组(vs. 0.41±0.12, P < 0.05)和正常对照组(vs. 0.21±0.06, P < 0.05)。而肝组织中Foxp3 mRNA的相对表达量在ACLF组,CHB组和正常对照组分别为1.55±0.15, 1.00±0.31和0.17±0.04,两两比较差异具有统计学意义(均P < 0.05)。5 ACLF患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞频率与HBV DNA复制和疾病严重程度正相关ACLF患者和CHB患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞频率均与血清HBV DNA载量成正相关(ACLF组:r = 0.36, P = 0.04; CHB组:r =0.62, P < 0.001),但其与ALT水平及HBeAg/抗-HBe状态无相关性。此外,ACLF患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞频率与INR(r = 0.64, P < 0.001)和MELD评分(r = 0.37, P = 0.04)成正相关。6 ACLF患者血清IFN-γ/IL-10比值失衡及血清IL-10水平与外周血CD4+CD25+调节性T细胞频率正相关血清IFN-γ和IL-10水平在ACLF组(0.96±0.37 pg/ml; 0.77±0.33 pg/ml)显著高于CHB组(vs. 0.40±0.17 pg/ml; 0.48±0.27 pg/ml;均P < 0.001)和正常对照组(vs. 0.37±0.17 pg/ml; 0.54±0.38 pg/ml;均P < 0.001),但是后两组比较差异无统计学意义。而IFN-γ与IL-10比值在ACLF组出现失衡,显著高于CHB组和正常组。血清IL-10水平与外周血CD4+CD25+调节性T细胞频率在ACLF组呈正相关(r = 0.41, P = 0.02)。7不同预后的ACLF患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞频率的动态变化规律根据ACLF患者30天的观察结果,将其分为存活组和死亡组。死亡组患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞频率在基线水平显著高于存活组(6.68%±1.32% vs. 5.44%±1.18%, P < 0.05),在第7、14、21和28天分别为7.23%±1.34%, 7.79%±1.20%, 8.82%±0.91%和8.91%±0.18%,并呈现渐增高趋势;而存活组患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞频率在各观测时间点分别为5.53%±1.28%, 5.28%±1.03%, 4.45%±0.87%和3.47%±0.61%,呈现逐渐降低趋势。结论:1 HBV相关ACLF患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞及肝组织内Foxp3+细胞水平较CHB患者及正常对照组明显增多。2外周血CD4+CD25+调节性T细胞频率在ACLF患者中与HBV复制及疾病严重程度正相关;外周血CD4+CD25+调节性T细胞频率的基线水平及动态变化趋势可作为评价短期预后的指标。3 HBV相关ACLF患者IFN-γ/IL-10的比值失衡,血清IL-10水平与外周血CD4+CD25+调节性T细胞频率正相关。4免疫调节治疗可能成为HBV相关ACLF的一种新的治疗策略。