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背景癌症严重危害人类的健康,其中宫颈癌是危害女性健康的第二高发肿瘤,而持续高危型人乳头瘤病毒(HPV,humanpapillomavirus)的感染是导致宫颈癌的关键因素。虽然目前已经有二价、四价和九价三种预防性HPV疫苗获批上市,能够引发与病毒颗粒结合并阻止其进入宿主细胞的中和抗体的产生,但其对已确定的HPV感染者或HPV引起的相关肿瘤缺乏治疗效果。因此,迫切需要开发有效的治疗性HPV疫苗。基于HPV癌蛋白E6或E7衍生的合成长肽(SLP)疫苗,在用于治疗与HPV相关的恶性肿瘤的临床前研究和临床实验中已经显现出令人兴奋的结果。但肽疫苗的临床疗效往往受到其易于酶促降解以及免疫原性低等缺点的限制,不足以激发机体的细胞免疫应答以清除病毒或病毒感染的细胞。此外,佐剂(adjuvant)是肿瘤疫苗重要的组成部分,而目前缺乏安全有效的佐剂以促进HPV肽疫苗的抗原特异性免疫反应,因而导致HPV肽疫苗在临床应用中受到极大的限制。被广泛应用的铝佐剂主要激发体液免疫应答,不利于激发细胞免疫应答。因此,解决肽疫苗的不足和寻找安全有效的新型疫苗佐剂以提高基于肽疫苗在肿瘤免疫治疗(immunotherapy)中的作用至关重要。ATP是最重要的细胞内代谢产物之一,同时也是可激活免疫系统的内源性胞外危险信号。在肿瘤细胞发生免疫原性死亡(ICD,immungenticcell death)时,ATP发挥了重要的免疫调控作用,是一种有潜力的疫苗佐剂。目的解决肽疫苗的全身性扩散、易于酶促降解以及免疫原性低的缺点,寻找安全有效的新型肿瘤疫苗佐剂以促进基于肽疫苗在肿瘤免疫治疗中的作用效果,为肿瘤免疫治疗提供新的思路和策略。内容和方法为了进一步提高肽疫苗的免疫效应,我们通过双乳液-溶剂蒸发法开发了 一种乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA,poly(lactide-co-glycolide)-acid)纳米颗粒(NPs,nanoparticles),该颗粒成功包裹了 HPV16 E744-62抗原肽(E7-NPs),并使用腺苷三磷酸(ATP)作为新型佐剂成分。以Transwell实验评估ATP佐剂对骨髓来源树突状细胞(BMDCs)迁移或募集的影响,并通过滴鼻以评价ATP在动物模型体内对免疫细胞浸润的影响。此外,通过透射电镜(TEM)和动态光散射(DLS)以检测纳米疫苗(nanovaccine)的形态、粒径大小和多分散系数(PDI),并以透析技术分别评估抗原E7肽和佐剂ATP在纳米体系中的释放动力学特性。以动物活体成像系统监测纳米疫苗在注射位置的滞留时间以评估其在体内的稳定性。将TC-1肿瘤细胞接种于C57BL/6小鼠右侧腹部皮下以建立HPV移植肿瘤模型,利用该肿瘤模型进行ATP佐剂化纳米疫苗(ATP+E7-NPs)的预防性免疫干预,并对无肿瘤小鼠进行第二次TC-1肿瘤细胞的攻击,以评估ATP+E7-NPs是否激发长效的免疫保护。在治疗性免疫干预策略中,当建立的肿瘤直径至5-6 mm时,利用ATP+E7-NPs进行治疗性免疫干预。考察免疫干预策略中小鼠移植肿瘤的动态大小,并检测小鼠脾脏中系统性的抗肿瘤免疫应答情况以及肿瘤局部性免疫效应细胞和免疫抑制细胞的浸润情况。结果新型佐剂ATP能够有效促进BMDCs的迁移和成熟,并在体内增加炎性细胞的局部浸润。制备的纳米疫苗为球形,粒径大小在100-500nm范围内,以“抗原储存库”形式持续缓释抗原长达150h。与游离的E7肽相比,PLGA纳米颗粒包封E7可提高E7的体内稳定性,增加抗原在注射位置的滞留时间,而且提高了淋巴结积累和树突状细胞摄取。更加重要的是,与E7-NPs相比,以ATP作为纳米疫苗佐剂后,其进一步增加了树突状细胞的迁移、纳米颗粒摄取和成熟。在动物肿瘤模型中,ATP+E7-NPs进行的预防性免疫干预能完全消除TC-1肿瘤的生长,100%的小鼠达到无肿瘤。在第二次肿瘤攻击后,ATP+E7-NPs提供了针对肿瘤第二次攻击的持久性免疫保护,显著抑制肿瘤的生长。ATP+E7-NPs免疫不仅显著增加小鼠脾脏中CD8+和CD4+效应细胞的比例,而且显著增加了 CD8+细胞中CTLs(CD8+IFN-γ+))和CD4+细胞中Th1(CD4+IFN-γ+)的比例。在治疗性免疫策略中,以ATP+E7-NPs进行的治疗性免疫仍显著抑制肿瘤的生长,增加小鼠脾脏和肿瘤组织中CTLs和Th1细胞的比例,并有效抑制包括调节性T细胞(Tregs,regulatory T cells)、骨髓来源的抑制性细胞(MDSCs,myeloid-derived suppressor cells)在内的免疫抑制性细胞的系统性生成和肿瘤浸润。结论本研究表明,ATP是有效的疫苗佐剂,以ATP作为佐剂的纳米颗粒疫苗能够激发强大的抗肿瘤细胞免疫应答,这可能为临床恶性肿瘤(例如宫颈癌)的治疗提供有前途的候选疫苗。