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抗NMDA受体脑炎(anti-NMDA receptor encephalitis)具有类似于边缘叶脑炎症状特点,如认知障碍、精神行为异常、癫痫发作、意识障碍等,其中精神行为异常较边缘叶脑炎更重,同时认知障碍更加典型和突出,并可有累及脑干产生的中枢性通气不足、意识不清等症状。NMDA受体广泛分布于神经系统,在端脑、胼胝体回、海马、丘脑、纹状体、小脑、脑干、脊髓、肠道神经等均有大量分布,其他部位也有存在。目前抗NMDA受体脑炎诊断主要依据是抗NMDA受体NR1亚基IgG抗体(+)。NR1亚基IgG抗体在抗NMDA受体脑炎患者脑脊液中阳性率为100%。抗NMDA受体抗体检测对抗NMDA脑炎的诊断具有非常高的敏感性和特异性。目前实验室检查金标准为间接免疫荧光法,目前生产该检测试剂盒的均是欧洲和美国厂家,其中在国内被大量使用并被临床验证过的检测试剂盒是欧蒙公司生产的抗体检测试剂盒。价格昂贵。如果检测患者抗体滴度,以及同时检测血清、脑脊液标本,则单次检查费用要提高数倍。研究目的:通过构建过表达NMDA受体NR1亚基的293T细胞,实现一种成本较低的检测抗NMDA受体自身抗体的检测方法,并在实验室内初步进行抗NMDA受体脑炎患者抗体检测并与商品化试剂盒进行比较验证检测效率。研究方法:1、对携带GRIN1基因的载体质粒进行PCR扩增,获得GRIN1全长编码序列,然后通过酶切、连接将该序列接入FUGW质粒载体,获得FUGW-GRIN1-IRES-EGFP质粒。2、将连接后载体转化感受态大肠杆菌,进行质粒扩增,收集并鉴定质粒。3、通过四质粒系统将FUGW-GRIN1-IRES-EGFP转染293T细胞,进行慢病毒包装。4、待293T细胞内病毒包装、释放完毕,收集含病毒载体的细胞培养液,通过离心收集病毒。5、用携带GRIN1基因的慢病毒载体感染目标细胞293T细胞并验证GRIN1基因表达。6、以实验室保存的经检测抗NMDA受体抗体阳性以及阴性的病人脑脊液样本孵育表达GRIN1的293T细胞,并进行免疫荧光检测,分析样本中的抗体情况并与商品化试剂盒进行比对。研究结果:1、成功构建慢病毒载体FUGW-GRIN1-IRES-EGFP。2、成功包装携带GRIN1基因的慢病毒颗粒。3、成功构建过表达GRIN1基因的293T细胞。4、过表达293T细胞对抗NMDA受体抗体的检测阳性率,与商品化试剂盒的一致率为95%。结论:1.选择与国外产品不同的构建方法,优选慢病毒载体系统构建过表达GRIN1基因的细胞株,我们成功的将慢病毒颗粒感染293T细胞并高效表达NMDA受体NR1亚基蛋白。2.对于脑脊液内抗体滴度的估测,我们与国外检测试剂盒的估测结果相符。与国外试剂盒相比,我们采用双荧光标记,检测前观察绿色荧光表达情况即可判断目的基因的表达情况,过程简单,并且能够减少因构建细胞不表达或少量表达GRIN1基因而产生的假阴性结果,同时在抗体滴度的计算上更具有优势。4.根据目前实验结果,该项技术具有应用于实验室检测的应用前景。