论文部分内容阅读
研究背景:肿瘤免疫疗法可在不同类型或已扩散癌症的患者体内激发持久的抗肿瘤免疫应答,并且取得突破性的治疗进展。随着免疫检查点抑制剂（Immune Checkpoint Inhibitors,ICIs）和调节剂的发现,为已有的肿瘤免疫疗法提供新的思路,通过增强机体内固有的T细胞抗肿瘤反应,以杀伤肿瘤细胞。同时一些ICIs已经被监管部门批准应用于恶性黑色素肿瘤和血液恶性肿瘤。但由于ICIs治疗用于乳腺癌普遍存在治疗无效的案例,所以迄今为止没有一种ICIs被批准用于乳腺癌。所以为提高免疫检查点抑制剂治疗乳腺癌的潜在疗效,我们应该了解限制该疗法发挥疗效的机制,设计出有效的治疗方案,以克服肿瘤免疫疗法抗性。颗粒蛋白抗原前体（Progranulin,PGRN）,在免疫调控中发挥重要作用,主要是通过结合肿瘤坏死因子受体2（Tumor necrosis factor receptor 2,TNFR 2）而发挥抑炎效应。此外课题组前期研究发现,在乳腺癌中,PGRN可通过调控肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associated macrophages,TAMs）促进小鼠肿瘤生长和迁移,从而降低其生存率。由此提示PGRN在乳腺癌中具有重要的免疫调控作用,可能参与调控细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic lymphocyte,CTL）在肿瘤微环境中的分布和功能。目的:本研究将探索PGRN促进乳腺癌CD8+T淋巴细胞排除的作用及机制,为寻找治疗乳腺癌的免疫干预靶点提供实验依据。方法:收集来自重庆医科大学附属医院的乳腺癌和癌旁正常组织样本,免疫组化检测组织中PGRN和CD68的表达情况。将C57BL/6小鼠来源的乳腺癌细胞PY8119分别注射至野生（Wild Type,WT）C57BL/6小鼠和PGRN-/-C57BL/6小鼠的乳腺脂肪垫中,构建乳腺癌原位模型,观察小鼠的肿瘤大小和小鼠生存期的变化趋势。通过对比WT和PGRN-/-组的肿瘤大小、生存率和肺组织病理切片等结果,明确PGRN乳腺癌在肿瘤生长具有一定促进作用。釆用流式细胞术（Flow cytometry,FCM）对小鼠肿瘤组织免疫细胞进行分类计数,同时免疫荧光检测肿瘤组织中M1型和M2型巨噬细胞表面标志蛋白表达变化,然后将氯膦酸脂质体或CSF1R小分子抑制剂Ki20227经腹腔注射治疗小鼠,利用FCM、荧光TUNEL、免疫荧光等手段,明确PGRN对TAMs和CD8+T细胞的调控作用。体外培养WT和PGRN-/-小鼠的腹腔巨噬细胞,利用IL-4将其诱导极化为M2型巨噬细胞,然后收集培养上清,通过细胞因子芯片筛选实验,明确主要作用细胞因子为ICAM-1。分别将WT组和PGRN-/-组的小鼠骨髓细胞移植于WT组小鼠体内,然后将WT和PGRN-/-的乳腺癌细胞PY8119移植到WT+WT BMCs组和WT+PGRN-/-BMCs组的小鼠体内,明确PGRN的主要来源。最后通过靶向PGRN和a PD-1的联合治疗,再次观察小鼠肿瘤大小、细胞凋亡、CD8+T细胞数量和功能等变化,明确PGRN作为免疫干预靶点的作用。结果:1.免疫组化检测结果显示,PGRN在人乳腺癌患者肿瘤组织中的表达显著高于癌旁组织。比较WT组和PGRN-/-组的小鼠肿瘤大小和生存率,发现PGRN-/-组小鼠肿瘤生长缓慢,小鼠的生存期明显延长。表明PGRN对肿瘤的生长具有促进作用。2.PGRN在乳腺癌中促进巨噬细胞聚集,其中主要为M2型巨噬细胞。1)通过对肿瘤组织中免疫细胞进行分类计数,发现在WT组中,CD45+F4/80+的巨噬细胞明显高于PGRN-/-组。免疫组化检测结果显示,在人乳腺癌组织中,CD68的表达量明显高于癌旁组织,进一步分析发现在肿瘤组织中,PGRN的表达变化和CD68的表达变化成正比关系。由此表明PGRN可促进巨噬细胞聚集。2)流式细胞检测结果显示在WT组中M2型巨噬细胞（F4/80+CD206+）占比率高于PGRN-/-组,免疫荧光检测结果进一步显示,在WT组肿瘤组织中,CD206和Arg-1的表达量高于PGRN-/-组,CD86和INOS是表达量明显减少。3.流式细胞术检测结果显示在PGRN-/-组的肿瘤组织中,CD8+CD69+T和细胞数量高于WT组,相反,CD8+PD-1+T细胞数量低于WT组,表明PGRN可抑制CD8+T细胞在肿瘤内聚集和活化。4.免疫荧光检测结果显示在氯膦酸脂质体治疗组中,F4/80+巨噬细胞明显减少,说明氯膦酸脂质体能有效地耗竭巨噬细胞。通过观察肿瘤大小变化发现,氯膦酸脂质体治疗组肿瘤生长缓慢。免疫荧光结果显示在氯膦酸脂质体治疗组有大量的CTL浸润,但增殖指标Ki67在上述两组组织中均无明显差异。荧光TUNEL分析结果显示氯膦酸脂质体治疗组病理损伤较对照组小鼠明显加重,提示PGRN主要是通过调控巨噬细胞功能来抑制CD8+T细胞的杀伤功能,从而对乳腺癌细胞起到保护作用。5.免疫荧光检测显示WT组TAMs高表达CSF-1R,采用CSF-1R抑制剂Ki20227处理小鼠,通过观察小鼠肿瘤大小变化发现Ki20227治疗组肿瘤明显减小,肿瘤发生率（73%）与PBS组（100%）有明显差异,FCM检测结果显示Ki20227组中M2型TAMs的数量显著降低,免疫荧光检测发现CD8+T细胞数量增加,同时伴随肿瘤细胞凋亡增加,但肿瘤细胞增殖指标Ki67在两组中无差异,提示CSF-1R抑制剂Ki20227在PGRN促进TAMs向M2型巨噬细胞极化中发挥抑制作用,从而有助于CD8+T细胞瘤内渗入。6.体外培养WT和PGRN-/-小鼠的腹腔巨噬细胞,利用IL-4将其诱导极化为M2型巨噬细胞,然后收集培养上清,通过细胞因子芯片筛选实验发现,在WT鼠肿瘤相关巨噬细胞分泌的细胞因子中,细胞间黏附分子-1（Intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1）分泌量明显高于PGRN-/-组,Western blot和流式细胞实验与细胞因子芯片筛选实验结果相一致。体外培养原代WT组肿瘤巨噬细胞,将其分别与脾脏T淋巴细胞培养,FCM检测结果显示WT组TAMs明显抑制T淋巴细胞增殖和活化,加入ICAM-1中和抗体后,T淋巴细胞增殖和活化得到恢复,提示PGRN通过上调TAMs的ICAM-1表达从而抑制T淋巴细胞增殖和活化。7.利用CRISPR技术敲除乳腺癌细胞PY8119的GRN基因,Western blotting检测结果显示PY8119的PGRN蛋白表达显著降低。WT小鼠接受致死量（8Gy）X射线照射,分别通过尾静脉注射WT与PGRN-/-鼠骨髓细胞,琼脂糖电泳检测结果显示WT小鼠外周血PGRN缺乏,将WT和PGRN-/-PY8119分别皮下移植于以上两组小鼠,观察肿瘤大小,结果显示相比于PY8119WT+BMWT组,PY8119KO+BMKO肿瘤显著减小,PY8119KO+BMWT次之,PY8119+BMKO肿瘤大小变化较小。FCM检测结果发现PY8119KO+BMWT肿瘤组织中CD8+T细胞数量明显增加,同时CD8+CD69+T细胞百分比显著升高,同时M2型巨噬细胞数量减少,可见PGRN缺失有助于恢复CD8+T细胞的免疫杀伤功能。8.分别给予WT和PY8119KO组a PD-1治疗,发现PY8119KO组相比于其余两组来说肿瘤显著减小,FCM检测结果显示PY8119KO组在a PD-1治疗后,CD8+CD69+T细胞的百分比显著升高。提示PGRN的缺失可以改善乳腺癌的a PD-1治疗的效应。结论:PGRN在人乳腺癌中高表达,伴随巨噬细胞数量增加。一方面PGRN可以促进TAMs的肿瘤内聚集,有助于TAMs向M2型巨噬细胞极化,再一方面PGRN通过上调TAMs的ICAM-1的表达加强TAMs与CD8+T细胞的结合,从而抑制CD8+T细胞的功能。在小鼠乳腺癌模型中,PGRN缺乏能明显减低小鼠肿瘤负担,同时可以改善乳腺癌对a PD-1治疗的效应。这种由PGRN介导的基于降低CD8+T细胞功能的免疫抑制效应,为肿瘤免疫治疗提供新的思路。