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细胞蛋白 NOP53,又称 PICT-1(protein interacting with carboxy1 terminus 1),由胶质瘤抑制候选基因 2(glioma tumor suppressor candidate region gene 2,GLTSCR2)编码。在多种肿瘤细胞中,NOP53表达下调甚至消失。NOP53上存在多个核定位信号;核糖体应激时,NOP53从细胞核仁易位到核质中。NOP53能够与多种细胞蛋白及病毒蛋白相互作用。本实验室前期研究发现细胞蛋白NOP53能够特异性去除视磺酸诱导基因I(retinoic acid inducible gene-I,RIG-I)K63位泛素化链,从而抑制RIG-I活化,阻断Ⅰ型干扰素的产生。目的意义:本研究从细胞蛋白NOP53的表达与定位入手,研究病毒劫持NOP53以利于自身复制的机制,为揭示病毒-细胞互作机理提供重要的科学资料,同时为设计抗病毒蛋白类广谱抑制剂提供新思路。方法:(1)以单纯疱疹病毒Ⅰ型(herpes simplex virus1,HSV-1)作为模式病毒,通过RT-PCR、免疫印迹、空斑实验等试验研究过表达或基因沉默NOP53对病毒复制的影响;(2)使用激光共聚焦及核质分离的方法研究NOP53蛋白在HSV-1不同毒株感染情况下的亚细胞定位变化;(3)使用嘌呤霉素标记、免疫印迹、免疫共沉淀等试验研究蛋白NOP53与HSV-1γ34.5的互作及促进HSV-1复制的机理;(4)表达纯化NOP53模拟蛋白N3-T,其N3(aa 330-432)羧基末端区域含有人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(human immunodeficiency virus 1,HIV-1)衍生的细胞穿透肽Tat,通过RT-PCR、免疫印迹、免疫荧光、病毒滴度测定等方法检测重组蛋白N3-T对Ⅰ型干扰素抗病毒反应的抑制作用以及对多种病毒复制的促进作用;(5)利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术,构建靶向NOP53的短发夹RNA(shorthairpinRNA,shRNA),通过体内试验验证NOP53基因沉默能够抑制HSV-1复制。结果:(1)过表达NOP53(aa 1-478)或其羧基末端截短体N4(aa 250-478)均能显著提升HSV-1野毒株F(HSV-1/F)病毒滴度,并能轻微提升HSV-1 γ34.5缺失毒株(HSV-1/△γ34.5)的病毒滴度。反之,基因沉默NOP53降低HSV-1/F及HSV-1/△γ34.5病毒滴度:(2)HSV-1/F感染细胞后NOP53发生细胞质易位,而HSV-1/△γ34.5或ICP4缺失突变株HSV-1/d120(复制缺陷病毒)感染细胞后NOP53不发生明显的细胞质易位。构建NOP53出核序列(nuclear export sequence,NES)缺失突变体ANOP53不能易位至细胞质,其对病毒复制的促进作用也随之消失。在HSV-1/Aγ34.5感染细胞的情况下,外源表达-γ34.5能够诱导NOP53易位至细胞质;(3)外源转染NOP53或加入NOP53的模拟蛋白N4-T均能减少HSV-1/F感染的细胞中真核生物翻译起始因子 2 α亚基(eukaryotic initiation factor 2 subunit α,elF2α)的磷酸化,但不影响由HSV1/△γ34.5感染导致的elF2α磷酸化。基因沉默NOP53能够削弱γ34.5与PP1α之间的特异性相互作用及,γ34.5维持HSV-1毒力的能力;(4)重组蛋白N3-T形成三聚体,抑制干扰素β(interferon-β,IFN-β)及干扰素刺激基因(IFN-stimulatedgenes,ISGs)的表达,并降低干扰素调节因子3(IFN regulatory factor 3,IRF3)的磷酸化水平,促进属于5个家族的有包膜或无包膜DNA及RNA病毒的复制;(5)NOP53基因沉默能够显著抑制HSV-1在小鼠肝脏内复制,并减轻病毒造成的肝组织病理损伤。结论:(1)细胞蛋白NOP53在多种病毒感染时发生细胞质易位,HSV-1病毒蛋白γ34.5诱导NOP53出核,并利用后者招募PP1α以去磷酸化eIF2α,促进HSV-1复制;(2)重组蛋白N3-T能够穿透细胞膜进入细胞,抑制Ⅰ型干扰素抗病毒反应,促进多种病毒复制;(3)靶向NOP53设计的特异性shRNA能够抑制HSV-1在小鼠肝脏内的复制,减轻HSV-1造成的肝组织损伤。本研究揭示HSV-1 γ34.5劫持细胞蛋白NOP53促进病毒复制的机理,为抗病毒制剂的开发提供新靶点。