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目的:通过体内及体外实验,探讨氧化苦参碱对高脂高果糖诱导的肝细胞脂质沉积的影响及miR-182的介导作用。方法:1.体内实验:7周龄Wistar大鼠随机分为2组:对照组(NC)12只,高脂高果糖组(HFDHFr)24只。4周后再将HFDHFr组随机分为HFDHFr组和高脂高果糖加氧化苦参碱(HFDHFr+OMT)组各12只。HFDHFr+OMT组以0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为载体,给与氧化苦参碱80 mg/kg/d灌胃,NC组和HFDHFr组大鼠仅用载体灌胃。药物干预4周时,行腹膜下葡萄糖耐量实验(IPGTT)检测各时间点血糖值并计算血糖曲线下面积。药物干预4周后测量空腹血糖,留取血清和肝脏组织标本。ELISA法检测空腹胰岛素水平,切取肝脏组织标本检测甘油三酯含量。通过肝组织HE染色和油红O染色观察肝脏组织学改变。提取大鼠肝组织总RNA和miRNA,进行实时荧光定量PCR(RT-q PCR)和Western blot检测肝组织中固醇元件结合蛋白1c(SREBP-1c)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)和肉毒碱棕榈酰基转移酶1A(CPT-1A)的m RNA和蛋白表达;RT-q PCR检测各组肝组织中miR-182、miR-183-5p和miR-96-5p的表达。2.体外实验:用不同浓度的氧化苦参碱:0.1 mg/m L、0.2 mg/m L、0.4 mg/m L和0.8 mg/m L干预细胞,分别于0、12、24、36、48 h后计算细胞存活率。将HepG2细胞分为对照组(CON)、棕榈酸干预组(PA)和氧化苦参碱干预组(PA+OMT,OMT浓度0.2 mg/m L),于48h后收集细胞,测定各组细胞甘油三酯含量。通过油红O染色观察细胞内的脂质沉积情况。提取HepG2细胞总RNA和miRNA,RT-q PCR、Western blot检测HepG2细胞SREBP-1c、ACC、FAS和CPT-1A的m RNA和蛋白表达。RT-q PCR检测miR-182、miR-183-5p和miR-96-5p的表达。此外,棕榈酸培养的HepG2细胞转染miR-182inhibitor和mimic后,给与氧化苦参碱干预,Western blot检测SREBP-1c、ACC、FAS和CPT-1A的蛋白表达。结果:体内实验:1.各组大鼠空腹血糖、空腹胰岛素、IPGTT结果比较:三组大鼠空腹血糖、空腹胰岛素均有统计学差异(P<0.01);HFDHFr组0 min、15 min、30 min、60 min、120 min血糖值均较NC组显著升高,血糖曲线下面积(AUC)明显增加(P<0.01);HFDHFr+OMT组0 min、15min、30 min、60 min、120 min血糖均较HFDHFr组显著降低,血糖曲线下面积(AUC)明显减少(P<0.05)。2.氧化苦参碱对高脂高果糖喂养的大鼠肝脏脂质沉积影响2.1各组大鼠肝脏TG含量比较:与NC组相比,HFDHFr组肝脏TG含量明显增加(P<0.01),HFDHFr+OMT组肝脏TG含量较HFDHFr组明显减少(P<0.01)。2.2肝脏组织病理学检测结果比较H&E染色中NC组肝组织结构完整,未见明显脂滴空泡。HFDHFr组肝小叶结构紊乱,肝细胞肿胀,胞浆内可见大量脂滴空泡,HFDHFr+OMT组肝细胞形态好转,脂滴减少。油红O染色:NC组红色脂滴较少,HFDHFr组有大量红色脂滴形成,HFDHFr+OMT组脂滴明显减少。3.各组大鼠肝脏SREBP-1c、ACC、FAS和CPT-1A的m RNA及蛋白水平比较:与NC组比,HFDHFr组SREBP-1c、ACC、FAS的m RNA及蛋白表达增加(P<0.01),CPT-1A的m RNA及蛋白表达减少(P<0.01);与HFDHFr组相比,HFDHFr+OMT组SREBP-1c、ACC、FAS的m RNA及蛋白表达减少(P<0.01),CPT-1A的m RNA及蛋白表达增加(P<0.01)。4.基因测序结果显示与NC组相比HFDHFr组miR-182、miR-183-5p和miR-96-5p表达下调。5.各组大鼠肝脏miRNA的表达:与NC组比,HFDHFr组miR-182、miR-183-5p和miR-96-5p表达明显降低(P<0.01);与HFDHFr组比,HFDHFr+OMT组miR-182、miR-183-5p和miR-96-5p表达明显升高(P<0.01)。体外实验:1.氧化苦参碱细胞毒性作用氧化苦参碱浓度为0.2 mg/m L或更低时在24小时或更短的时间内不会抑制细胞活力。2.氧化苦参碱对棕榈酸(PA)培养的HepG2细胞脂质沉积的影响2.1 HepG2细胞内TG含量变化:与CON组比,PA干预后HepG2细胞内TG含量明显增加(P<0.01);与PA组比,PA+OMT组TG含量明显降低(P<0.01)。2.2油红O染色结果:CON组细胞无明显脂滴,PA组细胞有大量红染脂滴,PA+OMT组脂滴明显减少。3.氧化苦参碱干预对棕榈酸培养的HepG2细胞SREBP-1c、ACC、FAS和CPT-1A的m RNA及蛋白水平的影响:与CON组比较,PA组SREBP-1c、ACC、FAS的m RNA及蛋白表达增加(P<0.01),并且CPT-1A的m RNA及蛋白表达减少(P<0.01);与PA组比,PA+OMT组SREBP-1c、ACC、FAS的m RNA及蛋白表达减少(P<0.01),并且CPT-1A的m RNA及蛋白表达增加(P<0.01)。4.氧化苦参碱对HepG2细胞miRNA表达的影响:与CON组相比,PA组的miR-182表达降低(P<0.01);与PA组相比,PA+OMT组miR-182表达升高(P<0.01),miR-183-5p及miR-96-5p表达无统计学意义(P>0.05)。5.HepG2细胞转染miR-182 inhibitor后氧化苦参碱对SREBP-1c、ACC、FAS和CPT-1A的蛋白表达的影响:与CON组比较,PA组SREBP-1c、ACC、FAS的蛋白表达增加(P<0.01),CPT-1A的蛋白表达减少(P<0.01);与PA组比,PA+OMT组SREBP-1c、ACC、FAS的蛋白表达减少(P<0.01),CPT-1A的蛋白表达增加(P<0.01);转染miR-182 inhibitor后,与PA+OMT组比,PA+OMT+miR-182 inhibitor组的SREBP-1c、ACC、FAS蛋白表达增加(P<0.01),CPT-1A的蛋白表达减少(P<0.01)。6.HepG2细胞转染miR-182 mimic后,氧化苦参碱和miR-182mimic分别对SREBP-1c、ACC、FAS和CPT-1A的蛋白表达的影响:与CON组比较,PA组SREBP-1c、ACC、FAS的蛋白表达增加(P<0.01),CPT-1A的蛋白表达减少(P<0.01);转染miR-182 mimic后,与PA组相比,PA+miR-182 mimic组的SREBP-1c、ACC、FAS的蛋白表达减少(P<0.01),CPT-1A的蛋白表达增加(P<0.01);与PA组比,PA+OMT组SREBP-1c、ACC、FAS的蛋白表达减少(P<0.01),CPT-1A的蛋白表达增加(P<0.01)。结论1.高脂高果糖饮食可诱导大鼠肝脏脂质从头合成通路激活,抑制脂肪酸β-氧化,而氧化苦参碱可改善高脂高果糖饮食诱导的脂肪肝,抑制脂质从头合成,增加脂肪酸β-氧化。2.PA可诱导HepG2细胞脂质从头合成通路激活,抑制脂肪酸β-氧化关键酶CPT-1A的表达;而氧化苦参碱可抑制脂质从头合成相关酶类,并增加CPT-1A的表达。3.氧化苦参碱改善PA诱导的HepG2细胞脂质沉积的机制与其上调miR-182的表达而抑制脂质从头合成,增加脂肪酸β-氧化有关。4.miR-182过表达与氧化苦参碱对肝细胞脂质沉积发挥的作用相似,可作为后续研究靶点。